Re: [求救] hybridoma的問題,融不出來Orz
※ 引述《diploid (2倍體)》之銘言：
: 目前我是照著實驗室的protocol做,基本上跟台大莊教授的流程差不多
: 不過融了快10隻都出不來,快哭死了,完全都是在燒錢T口T
: 狀況最佳的幾次是在day 3~day 5左右還有數顆細胞存活,大概2,3顆聚集在一起
: 這些應該是有成功融出的融合瘤細胞,不過最後還是完全沒繼續生長&存活
: 目前想出的問題是
: 操作過程失當&無菌操作:不過以我這幾次的經驗我覺得完全不可能
: feeder cell:不過看了很多paper,很多人在做融合時也並未使用
: PEG:看了幾個protocol,有人在加入PEG時會順便攪拌一下細胞,或是靜置數分鐘
: 然後再加入media(RPMI 1640,DMEM)或PBS做wash
: myeloma cell:代數過高?基因型改變?
: 然後有人是直接將做完PEG&wash動作後離心下來的cell pelet不打散直接移到
: flask培養再做分盤(分到96孔盤)
: 而我是加入PEG>加入RPMI 1640>離心>加HAT medium將細胞沖散>直接分裝到96孔盤
: 這兩個步驟的差異會對融合成功率產生影響嗎?
: 有經驗的高手能提供一些意見嗎O_Q
你用的 myeloma cell 應是 NS1，我們用的是 SP2/0-Ag14，除了 medium
是 RPMI1640 外，其他應該沒什麼差別。
我們的 Protocol 簡述如下：
[METERIALS]
RPMI1640 200 mL
RPMI1640 (15% FBS) 50 mL with 50X HAT (Sigma H-0262) 1 mL
PEG 1500 (Roche 783 641) 0.7 mL 請指明使用羅氏，其他牌子效果有差
Myeloma cell (NS1) Flask T75 約 7~8 成滿，細胞數 10^7 以上
50 mL tube x4 Petri dishes x3
保麗龍板 x1 手術台 96-well Plate x3
大頭針 x12 1L 或 0.5mL 燒杯 x1
Timer x1 滅菌手術用具組 x1 五剪十鑷
針筒 x1
[METHODS]
1.操作前準備：
前一天 Myeloma 依狀況換掉一半 medium。
30 分鐘前，1L 燒杯裝超純水、200 mL RPMI1640 及 50 mL RPMI1640 (15% & HAT)
回溫備用。
2.以二氧化碳將小鼠犧牲，噴75% 酒精至毛微濕，移入laminar flow ，以大頭針
大字型固定在包覆鋁箔之保麗龍解剖台上。
3.工字型剪開腹腔，先剪表皮，固定後再剪開真皮 (勤換鑷剪，小心勿污染)，剪
開胸腔可見心臟仍在跳動，以針筒直接刺入心臟採集全血 (約0.5 mL)。
4.由根部剪下脾臟 (位於左腹長條囊狀深褐色，勿剪破！)，以3個 petri dishes
的 RPMI1640 洗淨 (洗時盡量去除白色組織)。
5.最後 petri dishes 中，以針頭密集刺脾臟，針筒抽 RPMI1640 注入脾臟內沖洗，
直至脾臟扁掉顏色變淡。將沖洗後之 RPMI1640 倒入50 mL離心管，置於 CO2 Incubator
靜置 5 min (使組織碎片沉降)，倒入新離心管，補 RPMI1640 至 30 mL 後與
Myeloma 同時離心 (900 rpm, 10 min)。
6.沖下 Myeloma，倒入新離心管，補 RPMI1640 至30 mL與脾臟細胞同時離心 (900
rpm 離心10 min) 後倒掉上清液，沉澱以指側輕敲餘液打散後加入新DMEM，此步
驟重複二次。(利用空檔，PEG 置於 CO2 Incubator 回溫，並以血球計數器計算
脾臟細胞與 Myeloma 數目) 脾臟約是 Myeloma 數目的 3~10 倍
7.混合 Myeloma 與脾臟細胞，補 RPMI1640 後以 900 rpm 離心 10 min，後儘量
倒掉上清液，沉澱以指側輕敲餘液打散。
8.於溫水上邊加邊搖晃tube，加入0.7 mL PEG，搖晃1 min，緩慢加入 2 mL RPMI1640，
加入 8 mL RPMI1640。馬上以 800 rpm 離心8 min，儘量倒掉上清液，沉澱以指
側輕敲打散後補餘下之 RPMI164。
9.以 800 rpm 離心 8 min，沉澱以指側輕敲打散後加入 50 mL DMEMX-HAT。
10.以無菌塑膠滴管分裝至 3 盤 96-well plate (每 well 3 滴共 150 μL，
邊加邊搖晃)。融合細胞置 37℃ CO2 Incubator 培養。
[細胞融合後步驟]
1.Fusion 後一周：顯微鏡檢，圈選有穩定細胞叢的 well，計算 fusion ratio。
若培養液蒸發太多，每 well 補一滴培養液。
視情況而定，請不要 medium 都快滿了還硬要滴，這樣很容易污染！
2.Fusion 後二周：大部分有長細胞的 well 之培養液變黃後，吸取 100 μL
培養液 (可稀釋 2~5 倍，或用原液) 至 ELISA plate 中 (ELISA plate
請事先 coating antigen，並 blocking) 進行 ELISA 效價測試，補 100 μL
RPMI1640 (10% FBS, 1/2HT) 回 fusion plate 中。
為確保 ELISA 試驗結果可信，請設計二重覆實驗。
3.Fusion 後二~三周：若融合細胞長得較慢，可稍微延後幾天讓細胞長得滿些
再測效價，ELISA 效價測試結果為正者，盡快進行限數稀釋，若有效價之 well
數目太多，可移至24 well plate，每個 well 拷貝一份冷凍起來保存。
4.限數稀釋：當融合細胞長八成滿時 (此時細胞較健康)，細胞密度為
~2 x 10^6 個/mL，理論上稀釋成每 well (100 μL) 有 1 個細胞即可得到
單株細胞，事實上單獨 1 個細胞容易死亡，可調整細胞密度至 2~5 個/100 μL，
讓多餘的融合細胞充當「飼育細胞」，這樣限數稀釋的成功率會大為提高。
快速限數稀釋：若 well 裡的細胞叢不大，顯微鏡下目視細胞數目 ≦ 1 成左右，
可將細胞叢打散，直接吸取 medium 至 30 mL DMEMX (10% FBS) 搖勻後分裝至
96 孔培養盤中 (每 well 兩滴或 100 μL)。
5.限稀後一周：顯微鏡下檢視是否有單一細胞叢並圈選之，限稀後一周才鏡檢的
原因是此時細胞叢長的比較大較容易分辨，且較不會形成假的細胞叢 (原本在
同一個 cluster，拿 plate 時震脫後繼續形成cluster)。每 well 補 RPMI1640
(10% FBS) 一滴或 50 μL。
6.限稀後二~三周：檢視 medium 有無變黃，若細胞叢不夠大，可將細胞叢打散以
加快細胞生長，吸取 100 μL 培養液 (可稀釋 2~5 倍，或用原液) 至 ELISA plate
中 (ELISA plate 請事先 coating antigen，並blocking) 進行 ELISA 效價測試，
或 copy 細胞至 24 孔盤培養，取變黃的上清液進行 Western-blot 效價測試。
效價測試請盡量在一個禮拜內完成，若超過一個禮拜請檢查單株細胞是否長滿，
若長滿請將細胞叢打散，抽走一半以上的細胞，以維持細胞的生長。
7.細胞株放大：有效價之細胞株轉至 24 孔培養盤，過3~4 天後轉至 T25 Flask
或 T75 Flask，再過一個禮拜後即可長滿 Flask。
8.細胞冷凍：T25 分裝成 2~3 個冷凍小管，T75 分裝成 5~6 個冷凍小管。
依你的情況，有可能是你的 myeloma cell 不行了 (變性) 或污染 (mycoplasma)
再買新的細胞株吧！也不貴，大概幾千塊而已。
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