Re: [討論] His-tag protein 純化問題

看板Biotech作者Fourfish (～四條魚～)時間16年前 (2009/09/04 23:59)推噓5(5推 0噓 11→)

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請教幾個問題： 1.你的sample黏不黏(稠)？黏的話請加點DNaseI試試看 2.你產生的protein多不多？濃不濃？我前陣子的經驗是lysate中protein太多一進column就沈澱了結果就塞管.... 因為你有濃縮的步驟所以建議不要把protein濃縮的太濃不然protein容易沈澱出來 3.純化過程所有buffer的pH是否正確、一致？記得要考慮一下protein的pI 不然容易在純化時沈澱 4.你在準備(或清洗)column時，將resin沖散後會不會看到resin慢慢聚成數個小團塊？或很多resin會黏附在column壁上？有的話，請一定要做clean up，或許你收的medium中有很多lipid，讓resin容易成團不散 5.你指的"只用三次"是指全新的resin剛用三次？還是舊resin重新packing用三次？如果是舊的，那請clean up。 Clean up的方法不外乎有溫和型：20% EtOH、70% EtOH、1.5M NaCl 暴力型：0.1-0.5% detergent、1M NaOH、8M Urea、6M Gua-HCl等和你分享一下我上次的超暴力clean up的protocol： (因為塞管lose超多protein所以不爽...) 我是用重力法沒用pump 只是開關全開流速最大加pipeting沖散resin a. 0.5M NaCl, 50mM EDTA, pH~7.0 column灌滿 (~50mL的colum, resin~2-3mL) b. ddH2O 灌滿兩次以上 c. 0.5M NaCl, 8M Urea, pH~7.0 至少5V 沖散靜置約5-10min d. ddH2O 灌滿兩次以上 e. 0.5M NaCl, 0.5% Triton X-100, pH~7.0 灌滿兩次以上 (以上步驟部分我有含20mM Tris 你也可以用自己的buffer或PBS) f. ddH2O 灌滿兩次 g. 1M NaOH 灌滿沖散後浸泡1hr h. ddH2O 灌滿兩次以上 i. 20% EtOH 灌滿一次 j. ddH2O 灌滿兩次以上 k. Recharge Ni、重新置換buffer平衡~ 跟新的差不多好用~ 以上給你參考希望對你有幫助... ps.請注意~這樣clean up超暴力效果不錯但resin也很容易掛... -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.94.205

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