Re: [求救] miRNA 的cloning
※ 引述《peggy814 ( )》之銘言：
: 最近準備要作miRNA的實驗
: 老闆是打算自己clone miRNA的 construct
: 看了paper之後
: 他們是clone pre-miRNA insert由PCR得到
: paper上使用的PCR primer是根據pre-miRNA的sequence
: 設計overlapping的primer
: forward和reverse的primer分別大概是60~80 mer
: 我找了幾個paper裡面所clone的miRNA
: 對了miRBase裡面的sequence之後
: 只能看出forward和reverse primer大概有overlap十幾二十個mer
: (不同的miRNA overlap程度不同)
: 想請問如果我要設計primer的話
: 是只要forward和reverse primer有overlap到就可以了嗎?
: 還是有其他的需要注意?
: 謝謝^^
其實 我們實驗室都不是這樣做的
只要合幾條primer就可以了 不需要用到PCR
把pre-miRNA兩端再加上vector的cutting site
ligation時一起丟進去就可以了
舉例來說:
vector兩邊的cutting site 是 BamH I 和 Hind III
pre-miRNA sequence是AAATTTCCGCGC
分別合兩條primer
G\GATC C AAATTTCCGCGC A\AGCT T
C CTAG\G TTTAAAGGCGCG T TCGA\A
primer 5'都要磷酸化才能黏的上 (可以請廠商加或買kinase自己加)
如果pre-miRNA太長 也可以分成好幾段 像這樣:
G\GATC C AAATTTCC GCGCAATTCCGGGTTA A\AGCT T
C CTAG\G TTTAAAGGCGCG TTAAGGCCCAAT T TCGA\A
請廠商加 一條要加大概1千多 時間也要比較久
所以我們都是買kinase自己做
如果只有一兩個construct也可以直接請廠商加
當然 siRNA也可以這樣做
希望對您有幫助
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