Re: [求救] 請教Western blot的問題

看板Biotech作者NKTcell (NKTcell)時間16年前 (2009/06/13 01:56)推噓6(6推 0噓 3→)

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※ 引述《soceress (贏了世界又如何)》之銘言： : 1.page的配方與running buffer,transfer buffer的關係 : 以前的實驗室的gel用的是molecular cloning裡的配方 : (30% acrylamide,1.5M pH8.8 Tris-HCl,SDS,APS,TEMED..這是下膠) : running buffer:含SDS的Tris-Glycine : transfer buffer:含SDS,Tris,Glycine,MeOH 20% : 現在這個實驗室用的是 : 30% acrylamide,3.0M pH8.8 Tris-HCl,40% glycerol,APS, TEMED : running buffer:含SDS的Tris-Tricine : transfer buffer:不含SDS,其餘同上 : 膠的配方主要差在SDS和glycerol ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 主要不是差在那兩種喔~ glycerol只是要增加SDS gel的density 主要是差在running buffer的Tris-Glycine及Tris-Tricine 這個差很多!!! 另外你確定running buffer含有Tris-Glycine的下層膠Tris-HCl PH是8.8嗎? 印象中好像是8.45 你可能要再查查看0.0? : 請問這兩種膠的用途有什麼不同呢?? Tricine的適合用來跑小分子蛋白 resolution佳視膠濃度的不同小到2kDa也可以明顯區分出來一般的SDS PAGE比較沒辦法跑那麼仔細原理的話就要自己去查查看嚕 : 如果上面的膠配上下面的transfer buffer會不會transfer效率變差?? : 如果上面的膠配上下面的running buffer會不會有問題?? (比方說膠過燙) : 我要跑的是60~70KD的蛋白質一般Tricine-SDS-PAGE 有分Anode及Cathode buffer PH分別是8.9及8.25 混著跑... 我也不知道會不會有問題剩下的問題有勞其他人補充啦~ : 2.transfer的條件如果改變會影響data趨勢嗎?? : 用含SDS與不含SDS的transfer buffer,趨勢會不同嗎?? : 目前學姐們有三種條件(大家用的都不一樣^^||),要看的仍是60~70KD的蛋白質 : a. 120V transfer 1.5hr : b. 100V transfer 1.5hr : c. 50V transfer 4hr : 自己是覺得應該不會改變趨勢... : 我一直習慣用b,做出來和一年前剛到新實驗室用a的結果相反......n=4,三重覆 : 於是試著用c,趨勢和b一樣 : 3.同一個sample同時load跑四片 : 染了同一個抗體,理論上4片的target protein都可以染得很清楚(這是已經確定的) : 結果固定某個檢體,兩片有(明顯),兩片沒有(定量結果為0) : 聽別人說可能是power supply在transfer過程中短路 : 還有沒有別的可能呢?? : 感謝各位耐心看完~~~ : 先謝謝大家的幫忙~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.138.178

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soceress

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soceress

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