[求救] 請教Western blot的問題

看板Biotech作者soceress (贏了世界又如何)時間16年前 (2009/06/12 22:31)推噓3(3推 0噓 13→)

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1.page的配方與running buffer,transfer buffer的關係以前的實驗室的gel用的是molecular cloning裡的配方 (30% acrylamide,1.5M pH8.8 Tris-HCl,SDS,APS,TEMED..這是下膠) running buffer:含SDS的Tris-Glycine transfer buffer:含SDS,Tris,Glycine,MeOH 20% 現在這個實驗室用的是 30% acrylamide,3.0M pH8.8 Tris-HCl,40% glycerol,APS, TEMED running buffer:含SDS的Tris-Tricine transfer buffer:不含SDS,其餘同上膠的配方主要差在SDS和glycerol 請問這兩種膠的用途有什麼不同呢?? 如果上面的膠配上下面的transfer buffer會不會transfer效率變差?? 如果上面的膠配上下面的running buffer會不會有問題?? (比方說膠過燙) 我要跑的是60~70KD的蛋白質 2.transfer的條件如果改變會影響data趨勢嗎?? 用含SDS與不含SDS的transfer buffer,趨勢會不同嗎?? 目前學姐們有三種條件(大家用的都不一樣^^||),要看的仍是60~70KD的蛋白質 a. 120V transfer 1.5hr b. 100V transfer 1.5hr c. 50V transfer 4hr 自己是覺得應該不會改變趨勢... 我一直習慣用b,做出來和一年前剛到新實驗室用a的結果相反......n=4,三重覆於是試著用c,趨勢和b一樣 3.同一個sample同時load跑四片染了同一個抗體,理論上4片的target protein都可以染得很清楚(這是已經確定的) 結果固定某個檢體,兩片有(明顯),兩片沒有(定量結果為0) 聽別人說可能是power supply在transfer過程中短路還有沒有別的可能呢?? 感謝各位耐心看完~~~ 先謝謝大家的幫忙~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 118.165.222.94

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tsubasawolfy

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