Re: [求救] Triton X 114 partitioning
我想我自己找到問題了
如果破菌不完全
則蛋白質量不夠
detergent phase 密度不夠重就無法自原先的溶液中被分離出來
因此要改進的話最好以freeze and thaw或是
french press等物理性破菌的方式於實驗前對細菌進行破菌
※ 引述《pocession (阿宗)》之銘言：
: 我是以Triton X 114 partitioning來進行membrane protein extraction的實驗
: 但在執行上出了一些問題
: 想請問大家一下
: 這方法的原理大致上是這樣的，
: 首先將細菌懸浮在含有1% triton x 114的buffer中，
: 並且置於冰上使蛋白質溶解於buffer，
: 接著離心去除細胞殘渣，
: 然後轉移至高溫(>30度)，
: Triton series detergent在較高的溫度時，
: 水溶性會降低，
: detergent會自行聚合，
: 接著再以離心的方式，
: 將溶液分成aqeuos phase和detergnet phase，
: deterent phase因密度較重，會出現於管中的下層，
: 而此時membrane protein就會溶於下層detergent phase。
: 但是在操作上出了一些問題：
: 首先我的實驗對象是Mycoplasma fermentans，
: 但是我以buffer懸浮它時，並以離心去除不溶的沉澱物時，
: 發現含有1% triton x 114 buffer並無法對菌體產生破菌
: 而有大量的沉澱物出現
: 而這個問題似乎影響了之後蛋白質萃取的量
: 請問這樣的現象正常嗎?
: 如果我懷疑菌沒破，
: 是否應該在實驗開始前引入破菌的步驟(free and thaw，sonication等)
: 第二個是我照著protocol上講解的操作，
: 發現分層並不明顯，因此我改用較高比例的triton X 114進行實驗
: 分層現象雖然明顯
: 但卻造成detergent phase中triton x 114的比例太高，
: 於SDS PAGE分析時影響蛋白質在膠中的移動，
: 可是幾乎所有的protocol都是寫1% tx114，
: 請問1% TX114會太少嗎?為什麼我沒辦法分層呢?
: 第三個問題則是有些PROTOCOL上寫要以swinging bucket rotor來進行離心
: 不過由於我沒有這種設備，因此我僅使用一般桌上型的離心機來進行離心
: 請問這樣的離心會對分層產生影響嗎?
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