[求救] Triton X 114 partitioning
我是以Triton X 114 partitioning來進行membrane protein extraction的實驗
但在執行上出了一些問題
想請問大家一下
這方法的原理大致上是這樣的，
首先將細菌懸浮在含有1% triton x 114的buffer中，
並且置於冰上使蛋白質溶解於buffer，
接著離心去除細胞殘渣，
然後轉移至高溫(>30度)，
Triton series detergent在較高的溫度時，
水溶性會降低，
detergent會自行聚合，
接著再以離心的方式，
將溶液分成aqeuos phase和detergnet phase，
deterent phase因密度較重，會出現於管中的下層，
而此時membrane protein就會溶於下層detergent phase。
但是在操作上出了一些問題：
首先我的實驗對象是Mycoplasma fermentans，
但是我以buffer懸浮它時，並以離心去除不溶的沉澱物時，
發現含有1% triton x 114 buffer並無法對菌體產生破菌
而有大量的沉澱物出現
而這個問題似乎影響了之後蛋白質萃取的量
請問這樣的現象正常嗎?
如果我懷疑菌沒破，
是否應該在實驗開始前引入破菌的步驟(free and thaw，sonication等)
第二個是我照著protocol上講解的操作，
發現分層並不明顯，因此我改用較高比例的triton X 114進行實驗
分層現象雖然明顯
但卻造成detergent phase中triton x 114的比例太高，
於SDS PAGE分析時影響蛋白質在膠中的移動，
可是幾乎所有的protocol都是寫1% tx114，
請問1% TX114會太少嗎?為什麼我沒辦法分層呢?
第三個問題則是有些PROTOCOL上寫要以swinging bucket rotor來進行離心
不過由於我沒有這種設備，因此我僅使用一般桌上型的離心機來進行離心
請問這樣的離心會對分層產生影響嗎?
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