[求救] 免疫螢光

看板Biotech作者 (Egg Dance)時間15年前 (2009/05/18 20:52), 編輯推噓8(8推 0噓 10→)
留言18則, 8人參與, 5年前最新討論串1/4 (看更多)
各位好，我是已經四個月沒有data的研究生... 目前主要是以HSV感染小鼠之後觀察皮膚的病理變化 在以H&E看組織變化，以及IHC確認HSV protein在皮膚的表現之後 下一步老師要我repeat已畢業學姐的實驗 確認在皮膚出現的infiltrating cell是什麼樣的細胞 使用的方法是免疫螢光染色，大概的步驟如下： 1. 從-80度取出slide，解凍15分鐘 2. 由於染的都是surface marker(CD3 or Gr-1等等) 所以我都是用ice cold acetone fix(可以順便permeablize) (如果是染intracellular molecule我會用PFA fix再用Triton permeablize) 3. PBS wash之後10% serum blocking 30 mins 4. 加入primary antibody(in 2% serum)在4度C染overnight 5. PBS wash之後加fluorochrome-conjugated secondary Ab(in 2% serum) 室溫30分鐘 6. PBS wash，Hoechst 33342 stain 然後染了四個月什麼都染不到 antibody做過titration了，也試過用PFA fix 也有拿direct-labeled primary Ab，一樣染不到 老師說會不會是我切完片之後沒保存好，所以antigen都degrade了 要我切完片就先沾一下acetone做quick fixation，也染不到 也試過不同厚度的section (5, 10, 20 micron)，染不到... 用IHC也染不到 我的positive control是lymph node和spleen的section，都染不到orz 學姊是畢業前兩個月突然想染什麼就染到什麼，老師也說簡直是miracle 但老師很確定那些data是真的，我也應該要染到 阿，不過真的很frustrated 不知道有沒有人能夠提供意見或一起討論呢 目前沒有把抗體出問題列入考量，因為染了三種marker都染不到(CD3,Gr-1,H597) 先說聲謝謝 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.112.121.97
推
05/18 21:54, , 1F
顯微鏡會不會出包?
05/18 21:54, 1F
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05/18 21:59, , 2F
應該是不會啦，共用儀器每天都有人用
05/18 21:59, 2F
推
05/18 22:06, , 3F
二抗的問題? 避光? mounting(anti-fade)?
05/18 22:06, 3F
推
05/18 22:07, , 4F
那二抗? 然後一抗? 與學姐的步驟是否一樣?
05/18 22:07, 4F
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05/18 23:54, , 5F
有避光。有使用螢光用的mouting medium。因為照學姊的步驟
05/18 23:54, 5F
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05/18 23:55, , 6F
染不出來，所以後來才又做很多修正，但一樣染不出來。
05/18 23:55, 6F
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05/18 23:55, , 7F
不能排除二抗有問題，但我用direct-labeled一抗也染不到
05/18 23:55, 7F
推
05/19 00:21, , 8F
1st Ab. 確定是抓老鼠的?
05/19 00:21, 8F
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05/19 00:23, , 9F
是的，都是學姊用過的抗體，datasheet我也確認過很多次。
05/19 00:23, 9F
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05/19 02:11, , 10F
抗體壞掉?!近期抗體也有人一起使用,且做得出來嘛?
05/19 02:11, 10F
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05/19 02:25, , 11F
是不排除啦，但我很不想接受三隻抗體同時壞掉這個事實orz
05/19 02:25, 11F
推
05/19 08:55, , 12F
try 10% TCA 15min on ice for sample fixation and perm.
05/19 08:55, 12F
推
05/19 08:58, , 13F
and/or skip the blocking step.
05/19 08:58, 13F
推
05/19 10:09, , 14F
check一下 抗體能否辦認fixation過的epitope
05/19 10:09, 14F
推
06/03 02:00, , 15F
不要用serum做blocking 換2~4%的BSA試試
06/03 02:00, 15F
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06/03 02:02, , 16F
不過在你確定抗體跟螢光系統沒有問題之後再試
06/03 02:02, 16F
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11/11 01:29, , 17F
是的，都是學姊用過的抗 https://daxiv.com
11/11 01:29, 17F
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01/03 16:55, 5年前 , 18F
try 10% TCA http://yofuk.com
01/03 16:55, 18F
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文章代碼(AID): #1A4LeADp (Biotech)
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