Re: [求救] 關於RT-PCR的一些問題
原文吃光光.....
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照您的說法~這應該所謂的半定量PCR (semiquantitative RT-PCR)
現在這種定量方式已經漸漸的被real-time PCR所取代
real-time PCR之所以可以取代半定量 是因為半定量有他的盲點存在
因為理想的PCR公式為 copy number ( N ) = sample (N 0 ) * 2^cycle number
但是這理想公式往往會因為Taq活性下降、dNTP濃度等原因使得PCR無法達到理想值
又因半定量PCR屬於end-point偵測 (即跑完PCR=>跑膠=>依亮度回推定量)
因此容易受到 1. pipet error 2.UV-BOX靈敏度 3.PCR起始濃度、cycle數
等因素影響 導致照膠時發現偽陰性(無差異)因而誤判為 無差異
========================以上是騙P弊的前言=================================
因此 如果經費上不是問題的話~我比較建議改採real-time PCR 進行實驗
若是想試試看半定量的話~
請先拿你PCR產物用分光光度計做定量 (請先純化)
然後做序列稀釋 10^-3 10^-4 ..... 10^-8
讓產物呈現 10^5 10^4 ..... 10^1
然後取這些濃度的標準品
做 cycle數測試 求得最適cycle數
ex:
10^-3 10^-4 10^-5 .....
10
C 12
y 14
c 16
l 18
e 20
22
數 24
26
28
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tube數 10 10 10
以上述的例子看來測試三個濃度就需要做30管PCR了
然後請取適量的PCR產物加等量的dye
在差不多厚度 相同濃度的agarose gel跑膠 (視產物大小，建議2%)
EtBr染的時間固定
照膠的條件固定 (光圈、秒數、焦距)
花了這麼大的功夫 終於可以定出"大概"的cycle數及濃度了
-----------------------這是騙錢的後續發展---------------------------------
先前我的實驗也是想先做半定量
然後取差異大的再做相對定量 (想幫教授省錢麻!! 多貼心阿~) (原PO得意貌)
後來做real-time PCR看到圖 才驚覺還是被半定量的偽結果給婊了
現在我都sample直接上real-time PCR
1個半小時內等PCR跑完可就解決一批該死的sample了~
而且又準確，何樂而不為呢?
p.s.1 我也是該死的準畢業生，但至今還不曉得是準畢業生 還準延畢生就是了
最近聽到一位老師說了一句非常中懇的話
"研究生距離畢業時間越接近，越容易激發出潛能，發現自己是萬能的!!"
大家一起加油吧!!
p.s.2 real-time PCR怕麻煩怕污染的話 直接買premix就好嚕~
p.s.3 另外~RNA抽得好不好，cDNA轉得好不好也會影響到定量的結果喔!!
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