Re: [求救] transform後長不出菌?

看板Biotech作者bluecsky (我要藍藍淡淡的天空)時間17年前 (2009/04/30 02:30)推噓6(6推 0噓 2→)

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※ 引述《kissme.bbs.@bbs.life.nchu.edu.tw (不時生滅的遊雲)》之銘言： : > 現在問題出現在 : > 我的insert 和vector ligate 16度C 16hrs後 : > transform 到 DH5alpha 裡都長不出菌來 : > 已經試過兩次了 : > 不知道到裡哪邊出了問題? : > 麻煩幫我解惑一下 : > 感恩呀~~ : insert與vector的莫爾數比是否為3 : 1 ?? 做cloning並沒有什麼魔幻數字 3:1 5:1 7:1...隨便你愛怎麼加都可以很多人根本連算都沒有算原則就一個 insert要比vector多做不出來長不出來有時候根本不一定是insert或vector的問題先檢查看看你的ligase buffer是否還正常?你的ligase是否還有活性? 這些都很簡單就能檢查你隨便找個vector切一刀讓他去self ligase看看就知道再來就是你的compent cell 的效率如何?或許這一批compent cell很糟又或許放太久了保存不好造成效率很糟那就要重做一批檢查這個也很簡單隨便找個vector拿1 ul做一次transformation就知道好..假設這些都沒問題那你就要想看看你的insert來源是什麼? 你做了什麼處理 ?他還有沒有帶者磷酸根? (遇過有人把vecotr跟insert都做CIP處理...當然連不起來) 如果沒有那你需要用kinase去幫他加上磷酸根(感謝指正) 還有你本身使用的溶液或是水有沒有DNA nuclease的污染? 換一些新的水或是新的溶液或許就做出來了 cloning做到現在好像除了第一次初學有算過一次比例..後來都沒再管了..XD 當然原則上是要算一下啦不過也不用執著於3:1或是什麼數字比例原則有抓到後面就是troubleshooting 加油吧 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 123.193.192.223

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yaliu

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bbiioo

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hurdle

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