[求救] transform後長不出菌?

看板Biotech作者 ( 新目標 新方向)時間17年前 (2009/04/04 17:27), 編輯推噓6(6推 0噓 14→)
留言20則, 8人參與, 7年前最新討論串1/3 (看更多)
我在做full-length的ZO-1 cloning 我將P出的ZO-1先接進TA clone中做藍白篩選 挑出了兩個OK的colonies 用KpnI and SpeI切下我的insert 大小約5.7Kb 再接進我的expression plasmid裡 我的plasmid是切KpnI and XbaI (補充一點:因為ZO-1太多RE site都是我plasmid上有的 所以我只好找切位可以互補的兩種RE) 現在問題出現在 我的insert 和vector ligate 16度C 16hrs後 transform 到 DH5alpha 裡都長不出菌來 已經試過兩次了 不知道到裡哪邊出了問題? 麻煩幫我解惑一下 感恩呀~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.229.71.118
推
04/04 17:56, , 1F
可能的原因太多了...每個步驟是否都有做positive control?
04/04 17:56, 1F
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04/04 21:15, , 2F
要用甚麼東西當positive control呀?
04/04 21:15, 2F
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04/04 21:25, , 3F
我覺得你可以另外找個人重做一次~說不定手法問題!!
04/04 21:25, 3F
推
04/04 23:06, , 4F
vector的兩酵素分兩次切看看，不行的話，換我做，三天給你
04/04 23:06, 4F
推
04/05 04:43, , 5F
我也想要樓上幫我做 XD 不過這就是Ligation (嘆)
04/05 04:43, 5F
推
04/05 10:59, , 6F
你的plasmid裡的XbaI site是gaTCTAGA or TCTAGAtc嗎??
04/05 10:59, 6F
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04/05 11:01, , 7F
如果是, 那你當初在purify你的vector時應該要用
04/05 11:01, 7F
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04/05 11:02, , 8F
dam deficient的strain, 因為dam methylase會block你的XbaI
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04/05 11:02, , 9F
所以, 基本上你的vector只有single cut...
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04/05 11:04, , 10F
PS: dam deficient strain: GM2163....etc.
04/05 11:04, 10F
推
04/05 15:24, , 11F
不過,若如樓上所說,應該會長出很多self-ligation的clone
04/05 15:24, 11F
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04/05 15:26, , 12F
都沒長的話,也許是ligation或transform有問題
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04/05 15:28, , 13F
如果你是用二倍ligation buffer的話,試著"稍微"聞一下
04/05 15:28, 13F
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04/05 15:30, , 14F
如果沒有臭味的話,就代表它失效了,或者乾脆跟別人借
04/05 15:30, 14F
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04/05 15:32, , 15F
ligation的東西來用,transform時也要做transform
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04/05 15:32, , 16F
efficiency control
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推
04/06 01:44, , 17F
ㄟ~~原PO應該有用alkaline phosphatase處理vector吧~~??
04/06 01:44, 17F
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04/10 11:27, , 18F
感謝大家 經搖過LB後 目前已經長出colony了 好開心喔XD
04/10 11:27, 18F
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11/11 01:23, , 19F
dam deficie https://noxiv.com
11/11 01:23, 19F
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01/03 16:53, 7年前 , 20F
可能的原因太多了... https://muxiv.com
01/03 16:53, 20F
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文章代碼(AID): #19roVwBh (Biotech)
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