Re: [求救] Western 的band糊糊的
※ 引述《abbyyam (ㄟ逼)》之銘言：
: ※ 引述《abbyyam (ㄟ逼)》之銘言：
: : 小弟最近做Western遇到的困擾是我的Target protein的band都糊糊的
: : 不夠shape，所以讓老闆非常的不滿
^^^^^^^^^^ 哈~我最近也遇到這個問題,洗出來的和原po簡直一樣,昨天剛解決 @@
: : 但是在actin的部分就很OK
^^^^^^^^^^^^^^^^^^我比您糟一點,我連Actin都糊掉了 >"<
: : 我的target protein的大小是50~55kDa左右
^^^^^^^^^^ 我的是60kDa (P-Akt)
: : 膠用過10%和12%的
: : Transfer是400mA 2.5hr (in ice bath)
: : 所以到底是哪邊出了問題呢?
: : 煩請幫忙 > <
: http://www.wretch.cc/album/album.php?id=abbyyam&book=12
: 圖在此
: 另外我跑膠是用80V和100V在跑的
^^^^^^^^^固定伏特跑膠我沒試過,我是固定安培
不過共通點應該都是不能跑太快 or 太慢
跑膠的時候如果發現marker已經開始糊了,就可以停止了
不夠sharp,我這邊做的修改有:
1.壓片時間縮短 (大約五分鐘左右就可以了)
2.電泳時間不要太短 or 太長
之前一開始趕時間就用40mA跑到底,只花了一個多小時,
不過出來的結果就是不夠sharp (要速度沒品質 ˊˋ)
後來用20mA跑約兩小時,過了stacking gel後改成40mA跑,效果不錯!
我老闆說他以前至少都跑三小時... \囧/
3.12% gel改成 15% gel
這邊就比較注意一下,電泳的時候,15% gel會比較慢,
而且band 的間距會比較小,會花比較多時間跑
如果觀察到marker已經開始糊糊的,就該停止囉~
4.transfer 我是用200mA 2hr (in 4度C 冰箱)就很夠用了
stir有轉動齁?!之前有一次沒注意到,結果出來的band...%&*#$
transfer的時候溫度太高也會讓band糊掉,嚴重的就什麼都沒了 >"<
400mA我覺得有點過高了,我最高只用過250mA 3hr
5.transfer buffer如果顏色有點藍藍的就重配吧
表示 marker 已經 "溶"(不知要怎麼形容) 進去了...
transfer的效果就不好了
希望以上我的經驗能有幫助,
祝 原po實驗順利喔 ^^
阿...這裡我想請問一個問題:
我的band顏色都很淺,沒辦法像原po黑的那麼漂亮
請問除了 顯影水 一抗 二抗 外,還有可能有哪些原因呢? 謝謝
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