Re: [求救] IHC/Biotin & DNA
※ 引述《Asialin ( )》之銘言：
: 這個不太可能
: 雖然沒有染過神經
: 不過就我用ABC system的經驗是沒碰過在細胞核有non-specific binding
: 通常ABC system會有的非專一性染色問題
: 是在肝臟或腎臟等有大量endogenous biotin的場合
: 一抗有時也是非專一性共染的元兇
: 建議你做一個normal IgG的negative control
: 這樣你至少可以釐清可能是哪個步驟出了問題
重新敘述問題...
冷凍切片的組織是有perfusion過的背根神經節
PBS wash都是5~10 min X3
H2O2 → Blocking(goat serum) → anti-G-CSFR → FITC antibody
↓
biotinated antibody → ABC → DAB
螢光的結果
明明是一樣的細胞
但卻有亮度不一的問題
即使兩個抗體都隔夜或二抗濃度增加並隔夜
亮度不一的問題依舊
但並沒有不專一的情形出現
即anti-G-CSFR專一性沒問題
染ABC-DAB則會出現明顯的不專一染色
Schwann cell/satellite cells不該出現
但卻極端明顯...
測試ABC亂來的可能性...
略過biotinated antibody
結果組織完全沒染上色
代表ABC沒問題
測試biotinated antibody亂來的可能性
略過anti-G-CSFR
組織很淡並沒有離譜上色
代表biotinated antibody也沒問題
Q1:
這樣看起來primary/secondary antibody 和ABC都沒有問題
那是哪裡有問題?
Q2:
螢光亮度不一的問題如何解決?
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疼只疼，這考試，通宵不濟
疼只疼，這題目，艱澀難解
痛只痛，這分數，一去不返
痛只痛，這學分，離我遠去...
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 192.192.93.37
※ 編輯: Rodrigo 來自: 192.192.93.37 (02/26 20:23)
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