[求救] Western bolt有下雨痕

看板Biotech作者cocoon121 (湛藍)時間17年前 (2009/02/18 14:20)推噓11(11推 0噓 31→)

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大家好我目前在做WB 所以以下有幾個問題想請教大家首先我先付上我跑的條件 transfer 250 mA 55 min blocking 室溫 1hr 以上 (5%牛奶 in 1X TBST) wash 3 次每次15分鐘以上一抗 (1:500) O/N wash 3 次每次15分鐘以上二抗 (1:2000) 1hr wash 3 次每次15分鐘以上 ECL呈色我先付上我單跑SDS-PAGE的圖 http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051429584&p=3 整個PAGE也只有我要的BAND 分子量也對可是 TRAN後我根據以上的條件去做圖變成這樣>< http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051423799&p=0 有BAND沒錯可是有下雨痕.... 老師是說我WASH沒做好可我後面再做還是都有耶@@ 做了好幾次都這樣.....有嚐試過抗體濃度改變可有還是有囧我和學姊討論是想說會不會是一抗本來就是這樣因為我的一抗是客製化抗體.....所以他來的時候是兔子血清本來是想說血清裡面很雜是不是有其他雜七雜八的蛋白質在裡面然後我就打電話去問產專產專說她覺得是我的blocking buffer 出問題可是我們家 blocking buffer 現配自己要用的自己配 1X TBST 也是新鮮的平均一天半用掉1L(公用 BUFFER) 重點是我們實驗室其他人跑都沒這個問題 = =||| 我現在跑的是plant protein 我之前有拿別人的sample跑 OK (別人的sample是 cell line) 我以前跑其他植物蛋白的WB也沒這個問題@@ 所以技術上應該是OK 所以想請教看看有人知道這個直線條的下雨痕是怎麼一回事嗎??? 是5%不對?還是我要用PBST????? 可 PBST和TBST有什麼樣的差別呢??? ps 有嚐試過室溫下兩小時可也是有下雨痕跡>< 還有一個問題ㄚ有一次我忘記把PVDF膜裁切然後去呈色發現他在高分子量的部份也有BAND耶 http://www.wretch.cc/album/show.php?i=azureblue&b=12&f=1051423801&p=2 可是 SDS-PAGE出來是沒有的阿 = =||||| 請問有人知道是為什麼嗎???? 謝謝 -- ※ 編輯: cocoon121 來自: 140.130.97.175 (02/18 14:35) ※ 編輯: cocoon121 來自: 140.130.97.175 (02/18 14:36)

推

stanley300

02/18 14:42, , 1^F

02/18 14:42, 1^F

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