[求救] 關於小分子蛋白的western blot
請問一下板上的先進們
我有一個target protein 他分子量只有6kD左右
在跑western的時候總是看不到小分子的蛋白質
因為total protein是從組織粹出來的 所以比較雜
就想說用15%的膠來跑
可是transfer後就都hybrid不到 15kD以下的蛋白都很乾淨 囧
想問是不是transfer的問題
我做的條件是
running是用80V 然後換120V...大概跑個1~2小時
transfer 100mA overnight或250mA 3hr 在4度c冰箱中操作
PVDF membrane是0.2um的孔徑
blocking 5% non-fat milk overnight 4度c
wash
1抗 500倍到5000倍都試過了@@ 1抗應該是沒問題 因為我IHC做得出來
wash
2抗 5000倍
wash
壓片...
結果出來...15kD以上的雜band是看得到 可是以下的band就很乾淨.....
應該不是跳海的關係啦@@ 因為marker都還看得到
請問這是出了什麼問題呢? 嗚 我已經快失去信心了
還請各位大哥大姊幫我找到問題的所在>"<
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.84.124
推
02/16 22:28, , 1F
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不過我做IHC是看得到蛋白的 所以我在懷疑是不是target protein濃度低
所以看不到東西 IHC用Avidin-biotin Complex 所以放大訊號才看到
推
02/16 22:33, , 2F
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02/16 22:34, , 4F
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我跑的位置也差不多 可是我就是看不到啊 嗚
推
02/16 22:48, , 5F
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嗯嗯 我來試試tricin好了T_T
推
02/16 23:04, , 6F
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我的positive control有放 不過也是沒看到耶...
會不會是我gel running的時候溫度太高 斷光了啊@@ 跑SDS-PAGE在低溫跑會比較好嗎
嗚哦 我的問題好多>"<
推
02/16 23:52, , 7F
02/16 23:52, 7F
嗯嗯 這個我會注意 下次做我縮短時間
推
02/17 00:31, , 8F
02/17 00:31, 8F
有考慮過...不過可能是非不得以才會用 因為不太會做 用買的也不便宜>"<
推
02/17 10:59, , 9F
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02/17 10:59, , 10F
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02/17 11:05, , 11F
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嗯嗯 了解 感謝啊^^ 我來試看看tricine如何 再上來跟大家報告XD
推
02/17 14:35, , 12F
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明天我試試把時間縮短 希望可以跑得出來 XD 不過400mA會不會太強啊
因為我沒試過400的^^"
※ 編輯: tsk 來自: 140.112.84.124 (02/17 18:33)
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02/18 21:38, , 13F
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11/11 01:17, , 14F
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01/03 16:51,
5年前
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