Re: [問題] Western Blot 之疑問?
※ 引述《sweetapril (sweetapril)》之銘言：
: 想請問大家在做western時,
: 1. 同一批sample會壓幾次呢?? (所謂的2重複 3重複是什麼意思呢?跟n值一樣嗎)
: 若"第一次"所壓的5管sample就有想看的趨勢了,大家還會將這5管sample再壓一次嗎?
: 還是再重新收另一批sample來增加 n 值呢?
我會重新收一批耶 如果sample第一次壓就把想收的data都收齊了
我就不會再跑第二次了 浪費時間
: 2. 一抗的部份,如果overnight超過48小時,對蛋白表現會有不好的影響嗎?
: 以 Rho A 為例,之前試過O/N 16小時 --- 影像不明顯 (一抗1:500, 二抗1:5000)
: O/N 24-36小時--影像較清晰了(一抗1:500, 二抗1:5000)
我不知道Rho A好不好壓 但是我覺得一抗的時間16跟24hr 效果是差不了太多的
你可能要想想 是不是protein含量很少 是的話看要不要增加loading的protein量
或是用的一抗比例的關係 或者你一抗是用什麼buffer稀釋也有影響
: 3. 如果要跑分子量20-26kd,製15%的膠會比較好嗎??
: 我現在都跑12%的膠,但因為要看的分子量下方有一條很近的雜band,
: 跑到跳海了,還是沒辦法分的很開 = =///
用15%跑會比較好 我之前實驗有要看14kd的protein 用12%跑也是跟你一樣
會跟最下面的雜band很接近 但是15%的膠要跑得漂亮要用低電壓跑
我都用80V跑2.5hr 這樣band很直很紮實 不會暈開或拖尾巴
: 4. 低分子量時,通常transfer的 伏特數和時間 是用多少呢?
: (Rho A--24kd-- 我用100V,60分鐘,這樣會太少or太久嗎?)
: 謝謝^^
低分子量我不會改transfer的時間耶 我都用400mA 60min也是沒問題(14kd的protein)
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02/11 17:54, , 1F
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