Re: [求救] Western 新手的問題
※ 引述《cecik (追隨風那樣)》之銘言：
: 最近才開始做western，但是因為身在國外語言障礙很大
: 光是學完wetsern已經耗掉我和那邊唯一勉強會通英文的人的很多體力
: 所以有些網路上查不到的資料只能向版友請教了，希望大家見諒
: 1. 請問大家hybrid inetrnal control (如actin)
: 是會跑另一片膠?還是用原來的membrane(看target protein的)striped後再染呢?
: (對不起這問題很基本但是我蒐尋一堆關鍵字都找不到...)
: 能簡述一下方法嗎?
看你在染一抗的時候會不會切割到mambrane,如果不會切到actin的位置或者是你根
本沒有切membrane,就可以Striped,方法如下:
1.顯影過的membrane TBS-T再wash3次
2.stripping bfr 56oC 處理20~30分鐘
3.TBS-T wash 3次
4.5%脫脂奶粉 in TBST blocking 1 hr (此步驟可以省略,不過效果較差)
5.TBS-T wash 3次
6.再加actinㄧ抗
接下來的作法就如同一般2抗的作法
如果會切到membrane 就要重跑ㄧ片了
: 2. 請問準備sample時，protein extraction要保存是有先經過什麼處理嗎?
: 因為很久以前曾經看過別的實驗室protein抽好後去測濃度
: 然後就用sample bf dilute到要做實驗的量，之後全部一起加熱95度後再放-80冰箱
: 現在的實驗室則是抽好後就凍起來，要做才稀釋再加熱
: 這兩種方式是都可以嗎，或是有優劣呢?
我也是抽好測好濃度就凍起來，要做才稀釋再加熱
不過反覆解凍會有protein降解的問題,凍起來前要先分裝~
如果sample bf dilute到要做實驗的量，之後全部一起加熱95度後再放
-80冰箱,應該也是可以~不過要調整濃度~增量減量的時候可能會有問題
: 3. 請問整隻手伸進去定影劑會有甚麼不良影響嗎? <--這問題大家可以跳過 XD
: 因為今天不幸手滑讓底片沉下去只好整隻手下去撈，覺得自己真蠢...
: 先謝謝大家了，如果有任何western的建議也歡迎不吝指教，感激 >"<
這題我跳過阿~上帝保佑你!
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