Re: [求救] 有沒有水稻actin PCR必殺條件

看板Biotech作者suming77 (Sophia)時間17年前 (2008/09/26 07:20)推噓4(4推 0噓 5→)

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※ 引述《lainhat (下一個天亮...)》之銘言： : 但意外的卻在第一次沒有P出actin的某個line有P出來=.=? : 之後也陸陸續續在不同的line都有P出actin 但都沒有全部sample都有 : 為了要達到每個lines都能順利P出actin當quantitative control : 所以已經快起笑了 rice actin 我有做過 RT-PCR，沒什麼問題你有PCR成功過就排除primer設計問題所以RT-PCR穩定不外乎 1. RNA與cDNA 品質 1st-cDNA仍易degrade 所以保存樣品RNA -80, cDNA -20 C 2. 全程冰上操作 3. PCR template量夠不夠 PCR 總體積20 ul 1st-cDNA大約用0.2~0.5 microgram : 想請問各位大大有沒有必殺條件 : actin要夾出的size為504bp : --------------------------------- : 最近跑的條件是 PCR條件照所買Taq 建議 : 93度C,1' : [93度C,30" : 55度C,30" : 72度C,20"]*25 如果你的Taq 1K/min 20sec太短了 504 bp 用35 sec比較保險 actin 25 cycle 應該能PCR出來作為positive control時不妨提高到32~35 作為quantity control follow實驗組cycle 數 20 25 應都OK : 72度C,10' : 4度C,--- : ---------------------------------- : 量 : cDNA 各2 (總體積100 ul，cDNA template 應1~2.5 micogram) : 5'(25uM) 1 : 3'(25uM) 1 : dNTP(10mM) 1 : Taq 0.3 : buffer 10 : ddH2O 補至100出頭(多個幾ul) : ------------------------------------- : 100(分成5管,每管20ul) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 218.170.49.151

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