[求救] 有沒有水稻actin PCR必殺條件
老闆要我做RT-PCR
先前有demon過一個line
RT有成功(第一次做 所以把珍貴的RT產物當PCR取3ul去跑膠)
也有把actin PCR出來(要當quantitative control / internal control)
但要看表現的轉殖基因卻沒有PCR成功
因此覺得很難
又拖了一陣子(覺得不能再拖了)
所以就先取5個lines先RT
前前後後已經PCR+跑膠有六次了
前幾次沒positive control
老闆說這樣哪知道是RT沒做好 還是PCR的問題
好 所以加了第一次demon做的RT去PCR
結果連要當positive control的line都沒成功
但意外的卻在第一次沒有P出actin的某個line有P出來=.=?
之後也陸陸續續在不同的line都有P出actin 但都沒有全部sample都有
為了要達到每個lines都能順利P出actin當quantitative control
所以已經快起笑了
想請問各位大大有沒有必殺條件
actin要夾出的size為504bp
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最近跑的條件是
93度C,1'
[93度C,30"
55度C,30"
72度C,20"]*25
72度C,10'
4度C,---
----------------------------------
量
cDNA 各2
5'(25uM) 1
3'(25uM) 1
dNTP(10mM) 1
Taq 0.3
buffer 10
ddH2O 補至100出頭(多個幾ul)
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100(分成5管,每管20ul)
我有算過濃度了
不知道是條件還需要再修改還是量還要再調?
機器是Bio-rad 綠色的
有大大有必殺就救一下吧>_<
因為搞定這個還有轉殖基因的也要搞 T_T
不太想浪費時間在學長姐必P的出來的東西上
拜託了 各位強者!
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推
09/26 15:53, , 1F
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