Re: [求救] 有關於SDS-PAGE transfer 的問題

看板Biotech作者 (希望夢想成真)時間17年前 (2008/09/23 21:02), 編輯推噓5(5推 0噓 9→)
留言14則, 6人參與, 7年前最新討論串2/2 (看更多)
※ 引述《borhen (希望夢想成真)》之銘言： : 有一個問題想向大家請教一下 : 我們實驗室是利用半乾式轉置槽做protein 轉置到membrane : 發現到一個很怪的現像 : 蛋白質sample為細胞total protein 所以理論上大到小都有 : 1. 我們把轉置完的sds-page 拿去染色 : 發現到大分子量的蛋白質 大部分留在membrane上 : 但小分子量的protein都是乾乾淨淨的 : 甚至放在最下層的3M paper 有發現protein marker的存在 : 請問各位專家 實驗到底發生什麼樣的事情~@@ : 請大家給點建議~~謝謝 ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.113.173.43
推
09/23 20:07,
轉漬？
09/23 20:07
推
09/23 20:12,
protein大小的差異，如果目標蛋白分子量大一點(>100kD)
09/23 20:12
→
09/23 20:13,
我會延長transfer時間10%~20%
09/23 20:13
推
09/23 20:42,
transfer太久小分子亮的protein會跑過membrane..
09/23 20:42
→
09/23 20:42,
不過還是要看你membrane材質(孔徑)
09/23 20:42
→
09/23 20:42,
量- -
09/23 20:42
目前最為常用的NC paper 跟 PVDF都有試過~@@ 都有這樣的現象產生 可是我一直再想~~ protein 太大會殘留再SDS-PAGE上 protein 太小transfer太久又會過頭 請問你們實驗~@@ 有這樣的現象嗎~~~~ 埃~~~~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.113.173.43
推
09/23 21:08, , 1F
當然也會遇到，所以要針對自己的目標蛋白抓condition
09/23 21:08, 1F
→
09/23 21:10, , 2F
以我的p53為例，使用Millipore的0.45um PVDF
09/23 21:10, 2F
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09/23 21:12, , 3F
我用每平方公分2mA 半乾式transfer 1hr，若大分子就久點
09/23 21:12, 3F
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09/23 21:14, , 4F
你不妨先參考membrane說明書的建議時間及安培數，再根據
09/23 21:14, 4F
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09/23 21:15, , 5F
你的目標蛋白抓condition，其實不會很麻煩
09/23 21:15, 5F
→
09/23 21:17, , 6F
對了，如果你是要看total lysate的話，我的經驗是
09/23 21:17, 6F
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09/23 21:18, , 7F
寧願讓大分子protein殘留一些在gel上，只要相對應的
09/23 21:18, 7F
推
09/23 21:22, , 8F
大分子marker大都有明顯的轉到膜上，sample量就差不多了
09/23 21:22, 8F
推
09/23 21:57, , 9F
buffer ?
09/23 21:57, 9F
推
09/23 22:30, , 10F
墊兩張membrane就好了XD
09/23 22:30, 10F
推
09/23 23:08, , 11F
1. transfer過頭了 2.使用孔徑小的membrane(0.2um)
09/23 23:08, 11F
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09/23 23:32, , 12F
謝謝大家~@@
09/23 23:32, 12F
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11/11 01:00, , 13F
寧願讓大分子prote https://noxiv.com
11/11 01:00, 13F
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01/03 16:45, 7年前 , 14F
我用每平方公分2mA https://noxiv.com
01/03 16:45, 14F
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文章代碼(AID): #18sEZPyG (Biotech)
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