Re: [求救]利用共軛顯微鏡觀察細胞內鈣離子的實驗方法
昨天我將已經seeging在3.5cm dish的HEK293細胞
加入 1 ul 5mM fluo-3-AM + 2ul 10% Pluronic F-127(in water)
於總體積1ml Kerbs-Henseleit buffer 中37度避光染色45分鐘
之後以Kerbs-Henseleit buffer 清洗三次
再加入Kerbs-Henseleit buffer 1 ml 於37度靜置30分鐘
這個實驗是模仿2003 JBC paper
paper上說當加入methacholine刺激時
HEK293細胞內的鈣離子就會變化
現在我遇到的問題就是
當昨天要先用488波長去看細胞有沒有染到fluo-3時
在細胞上完全看不到綠色螢光
幫我的老師是說連染劑都沒有成功進入細胞
他是說是因為10% Pluronic F-127是溶在水中
而非DMSO 造成無法把flro-3-am完全均勻溶解
且成功帶入細胞
我想問的是:
1.DMSO的含量真的會關係到染劑能否進入細胞嗎?
2.上面所做的protocol是不是有誤?
3.還有更好的方法或比例可以幫助fluo-3混合均勻/增加細胞染色效率?
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