Re: [求救] 請問限制酉每切完忘記去活性
※ 引述《lainhat (下一個天亮...)》之銘言：
: 小弟我做ligation做很久了
: 也看過精華區很多舊文了
: 但是有沒有接起來 到現在還是得靠運氣
基本上以我有作過的方面回答,缺的部分就請其他有經驗的人補足吧...
: 不同比例(測濃度算莫爾數)
1:3~3:1 到 1:5~5:1就我的經驗來說是沒有太大的差別的
(使用過的Vector為P-GEM T Easy以及PET-29)
: 不同總體積(5ul 10ul 20ul 25ul)
這部分最好將insert量提高,而且總體積縮小...
用以增加它接的機率...
: 不同方式去接(gateway 和 傳統接法)
: 不同transform法(電穿孔 和 熱休克)
使用DH5a以及BL-21兩種菌株皆以Heat shock方式...
: 不同ligase(NEB 和 Promega)
使用過promega以及其他台製ligase...
注意buffer保存良好就鮮少有接不起來的情形...
(T-A cloning以及blunt-ended PCR產物加上A後的ligation,以及Double digestion)
: 不同菌液量塗盤(200ul 和 濃縮)
這點就看個人,基本上菌落密度以挑菌方便為主...
不過有長最實在,沒長的話這一點影響力都沒有...
: 不同菌株(XL1-blue 和 Top10)
這以實驗設計為主,菌株的選擇當然是好養又好用為優先...
除非載體特別,不然都是以這為取向...
: 不同方式純化DNA(kit回收 或 軟膠回收)
使用Q牌miniprep作DNA回收以及Q牌膠體回收kit...
注意膠體回收會有產物lost以及後續ligation的問題...
最常見的問題就是接不起來,所以要是酵素剪切之後的片段占有80%以上...
而且剪切完的條帶相當清晰的話,我會偏向以phenol/chloroform > 酒精沉澱
的方式回收總剪切產物,算好比例之後直接拿去ligation...
有接出來再去篩片段總比沒接出來有用得多...
另外Q牌miniprep回收片段大小不同有不同方式,請參閱說明書...
Q牌膠體回收也有2%以下的限制,超過的話請參閱說明書...
: 不同條件去電菌(伏特 電阻 電容)
: 不同時間去熱休克(30" 60" 90" 120" 150" 180")
42度兩分鐘,competent cell加入ligation完的產物後輕輕以tip mix即可...
: 不同培養基去養菌
與選擇菌種有關,注意營養缺乏以及抗生素使用即可...
以上算是最基礎的分生實驗室會用到的東西與步驟...
歡迎補完...
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