Re: [求救] 請問限制酉每切完忘記去活性
※ 引述《A65 (對!我是零食控!)》之銘言：
: 如標題
: 如果我做完限制酉每切完忘記去活性
: 然後就直接拿去做ligation了...
: 請問這種狀況是不是一定會失敗了呢?
: 還是說有沒有什麼辦法補救?
: 太悲傷了 >"<
小弟我做ligation做很久了
也看過精華區很多舊文了
但是有沒有接起來 到現在還是得靠運氣
不同比例(測濃度算莫爾數)
不同總體積(5ul 10ul 20ul 25ul)
不同方式去接(gateway 和 傳統接法)
不同transform法(電穿孔 和 熱休克)
不同ligase(NEB 和 Promega)
不同菌液量塗盤(200ul 和 濃縮)
不同菌株(XL1-blue 和 Top10)
不同方式純化DNA(kit回收 或 軟膠回收)
不同條件去電菌(伏特 電阻 電容)
不同時間去熱休克(30" 60" 90" 120" 150" 180")
不同培養基去養菌
上述都試過了
說起來很可笑 也很沒效率 一個construct接一年接起來T.T
看到什麼都還蠻想試看看的
所以...如果限制切完沒有失活
然後跑膠用kit回收或軟膠phenol/chloroform回收
這樣真的會影響到ligation的效率嗎?
像ligation接完也是要失活 增加transformation的效率 是同樣的道理嗎?
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.130.87.174
推
08/25 16:08, , 1F
08/25 16:08, 1F
推
08/25 16:24, , 2F
08/25 16:24, 2F
→
08/25 16:29, , 3F
08/25 16:29, 3F
推
08/25 16:32, , 4F
08/25 16:32, 4F
推
08/25 16:57, , 5F
08/25 16:57, 5F
→
08/25 16:58, , 6F
08/25 16:58, 6F
→
08/25 16:59, , 7F
08/25 16:59, 7F
所以sisyphus大大的cloning因為有做inactive所以都蠻順的嗎?
另外老闆有試過ligation完 讓ligase失活 的確會增加效率 雖然對我來講沒改變
(菌連一顆都沒有 無從比較效率問題= =)
最近是懷疑Kit回收的問題 因為據說前人都沒有困擾 都是用軟膠回收的
所以也可能是有經phenol/chloroform的關係inactive restrict enzyme影響?
到我進來以後大都用Kit硬膠回收 cloning從此一蹶不振 大家都一樣沒得挑
想知道各位大大的cloning順的過程 究竟和我的步驟有沒有差
畢竟已經要升研三了 這樣還蠻尷尬的處境
雖然我相信自己不是最慘的 但也應該算慘的那一群了T.T
麻煩有寶貴經驗的大大多指教...先感恩了
※ 編輯: lainhat 來自: 140.130.87.174 (08/25 18:03)
推
08/25 21:26, , 8F
08/25 21:26, 8F
→
08/25 21:27, , 9F
08/25 21:27, 9F
推
08/25 21:36, , 10F
08/25 21:36, 10F
→
08/25 21:37, , 11F
08/25 21:37, 11F
→
08/25 21:37, , 12F
08/25 21:37, 12F
推
08/25 21:46, , 13F
08/25 21:46, 13F
→
08/25 21:47, , 14F
08/25 21:47, 14F
→
08/25 21:49, , 15F
08/25 21:49, 15F
接好的我就不說了
目前正在接的(算是基因置換而已)
insert(PCR再陸續純化出來的) 約3.75Kb
-geneA-
/ \
SbfI+BamHI EcoRV+SacII
vector是從一個老闆以前的construct 切完約5.3Kb(去掉geneB)
ubiP-ubiI-geneB-nos-pBS
| |
PstI SacII
SbfI和PstI切位一樣 所以可算同一切位
聽說DNA長短對ligation也有好接不好接的問題?
先前做一年的也是算基因置換 其實家裡作法通常是留construct
再依construct去設計primer 話說研一我也是每天抱著愉快的心情去做
(那時剛開始電plasmid都長滿滿整盤 都覺得很簡單又順利)
直到接完電完隔天看到沒長菌就傻了 從此就抱著既期待更怕受傷害的心情過日子了 囧
現在要升研三了連要做的實驗分析都還沒進行 再這樣耗下去實在不行
希望有撇步的大大傳授一下 不管怎樣有試有希望
現在問題其實蠻多的 我的用ampicillin篩選 時間久了都會長衛星菌落
(雖然大部分是連菌都沒長)
同實驗室的也有改接kanamycin的vector去避免這種情況
而我已經置換好promoter了(原本不是UbiP) 外加vector內有我的基因切位
所以只好治標不治本 硬著頭皮用ampicillin篩選
不過有加強濃度到1.5倍的量 讓菌長大顆一點又不至於有衛星菌落
也有換新的菌去做competent cell(懷疑原本的菌有改變 變的有抗性?)
但還是沒有改變沒長菌的事實 培養基也改用更營養的SOC去recovery
總覺得...很慘阿!
關於witchs大大問的transformation過程
我是取ligation產物(1~3ul)去電
有看過大陸文章對XL1-Blue最佳轉型效率是2.5KV 200歐姆 25uF
有去試過
因為原本機器推薦的1380V 125歐姆 50uF都沒長菌很困擾(circular form的很多啦)
電前從冰箱拿出competent後置於冰上一段時間自然融化
(老闆是說用手溫快速融化較好 兩者都做過 結果一樣沒啥變好的跡象 囧)
之後菌和DNA混合後置於冰上一段時間(約5' 最近這樣 以前沒在等的)去電
電完後用1ml LB 小心沖吸菌至養菌管 37度C shake約30'~60'
(有聽說電完直接沖吸 老闆說要等約5'~10' 讓DNA跑進菌裡 都試過 結果一樣慘)
當然更先前因為電都沒長single colony 所以有改用heat shock的方式做transform
這邊我也想問一個問題=o=P
就是heat shock通常是一管eppendorf將DNA加入去做吧
那各位大大會用eppendorf直接去搖 還是 吸至養菌管去搖?
我用eppendorf養感覺底部管壁都有沉澱物 總覺得很怪
有想到跟溶氧量是否有關係 有看精華區好像有說無氧呼吸菌容易長怪東西?
跟學弟討論 他是覺得短時間(30'~60')應該沒差
大概就是這樣了 歡迎指教
※ 編輯: lainhat 來自: 140.130.87.174 (08/26 05:41)
推
08/26 08:21, , 16F
08/26 08:21, 16F
推
08/26 08:35, , 17F
08/26 08:35, 17F
推
08/26 08:38, , 18F
08/26 08:38, 18F
→
08/26 08:38, , 19F
08/26 08:38, 19F
推
08/26 08:52, , 20F
08/26 08:52, 20F
→
08/26 08:54, , 21F
08/26 08:54, 21F
推
08/26 08:59, , 22F
08/26 08:59, 22F
→
08/26 09:00, , 23F
08/26 09:00, 23F
→
08/26 17:19, , 24F
08/26 17:19, 24F
→
11/11 00:56, , 25F
11/11 00:56, 25F
→
01/03 16:44,
7年前
, 26F
01/03 16:44, 26F
討論串 (同標題文章)