Re: [求救] Medium跑western
: ※ 引述《boblu.bbs@beta.life.nthu.edu.tw (六百)》之銘言：
: : ※ 引述《ballycotton7.bbs@ptt.cc (昂 布拉股)》之銘言：
: : > 最近要看一些外送到Medium中的protein
: : > 所以將medium拿去跑western
: : > 但是總是偶而會有band 較多時候有時候都沒有訊號 而且片子的background都髒髒的
: : > 我的方法是 先將約100ul的Medium加入loading dye之後下去煮過
: : > 將體積煮至40~50之後 loading
: : > 但是有時候煮過會發現底部有一些藍色的沉澱物
: : > 但是我還是全部loading下去
: : 這種煮到乾的做法有文獻可考嗎？
: : 感覺有點可怕
: : 而且我直覺認為鹽類濃度的改變會對結果造成一些難以預期的影響
: : 如果是我 我會用 centricon 之類的東西來濃縮啦...
: : 或者是作 IP or IP-western
^^^^^^^^^^^^^^^^^這是指用免疫沈澱法 取出我要的protein
然後再跑western嗎？
不曉得有沒有誤解您的意思
: 我想問你的是...你的medium裡有沒有serum..
: 聚我所知..serum影響很大
: 跑出來會有黑色ㄧ團
: 我後來是用serum free...
: 取2-3ml的medium濃縮至50-70 ul後加 loading dye煮
: 然後用well比較大的去跑
: 我是上層膠配比較長(也就是下層膠要比較短)
: 然後讓他跑一下下之後再把沒loading完的load完
: ^^
借個標題
我也是用濃縮的方式來濃縮我的medium (DMEM/F12;含2％serum)
方法是以抽真空的方式將體積濃縮
整個chamber的溫度大概10度C左右 也就是我裝sample的離心管也是10度C
總體積8ml-->200~500ul 約需6～8小時
我的問題是：
1. 像這樣沒有加protease、phosphorease inhibitor有沒有關係呢？
雖然我不是要看phosphoration 但還是會擔心degrade的問題
2. 如果要加 各位會選擇在濃縮之前加還是濃縮之後再加
前者我擔心會有鹽類過高問題而且需要加的量要很多（一管8ml 有12管）
後者我擔心在濃縮過程就有degrade了 濃縮後再加 會不會就失去時效性
補充：
我跟同學討論 有想說是不是先加個不是鹽類的inhibitor
如： PMSF頂一下 不過各位也知道 PMSF的半衰期約30min~60min
Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin 我不曉得是否很貴
如果很貴 大概也不能讓我拿來這樣揮霍
而其它如 NaCl、Na3VO4、NaF都會影響鹽的濃度
tris-base、 Na-deoxycholate會不會我不清楚( tris應該也會吧?!）
爬前文 有人說Aprotinin、Leupeptinin、Pepstatin、PMSF加多沒關係
所以我才把濃縮產生的問題專注在其它鹽類
雖然我也不確定是不是就真的上述四者不會影響
我知道millipore有賣 centricon Ampicon這種透析的管子
不過真的太貴了....orz
希望有前輩可以分享一下這方面的看法
感恩 ^^
※ 編輯: latte366 來自: 140.116.93.52 (03/13 04:38)
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