Re: [方法] 請問注射cell line至小鼠產生腫瘤模式갠…
※ 引述《oopa (11)》之銘言：
: 最近要使用Lewis lung cancer cell打入B6小鼠(非免疫缺陷鼠)建立腫瘤模式
: 根據要看的參數,欲分別採用尾靜脈注射與皮下注射方式注入細胞,觀察腫瘤發生的情況
: 關於這樣的模式在執行上有些問題想請教:
: 1.就目前個人搜尋的文獻中,皮下注射所使用的細胞量似乎都高於尾靜脈注射的細胞量,
: 這樣的認知正確嗎?還是我個人文獻閱讀量不夠,或剛好挑選到同類文章所造成的錯誤
: 認知?若認知無誤,可能原因為何?
: 2.根據文獻所言,打入靜脈的總細胞液量從100ul-200ul不等
: (200ul是protocol建議的最大量)
: 我有試過的結果,因為技術不佳,成功注入最多150ul左右,再多就推不進去了,
: (應該不是打到別的地方,因為注射時其他部位沒有腫脹,且在注射量達150ul前都順暢)
: 但因為該實驗無法等我技術完全OK後再進行,
: 因此在使用相同細胞數目下,總體積減少,勢必細胞濃度會增加
: 請問細胞如果濃度較高 對於老鼠本身是否有明顯影響?
: 有好心人可以分享經驗嗎?有沒有可能細胞太濃讓小鼠血管栓塞?
: 3.靜脈注射所使用的針頭需要使用幾號針頭才不致使細胞破裂?
: (目前練習使用26G針頭滅菌後的PBS)
: 以上問題還請好心的高手們分享經驗與看法
: 感謝^^
1.原po利用的Lewis lung cancer cell不知是那種tumor cell line
如果我猜的沒錯 跟我以前應該使用應該相去不遠
我是用B?/F10 nad B?/F0 都是melanoma cell line (lung cancer cell line)
兩個差別在 metastasis 能力強弱 (F10強)
如果是這類Cell 以下的資料 可提供原po一些方向
2. 就tumor model來看 使用這類的tumor 打回去B6上 的兩個優點
(1). 省下了immune的問題 因為是同種類mice上去分離出的細胞
(2). 這些是黑色素腫瘤細胞在 觀察及生長速度上 非常適合做研究 蠻快的
3. 原po內文中提到 SC 跟 IV 我都做過研究 基本上 以我個人看法
這是兩個不同的model所以 cell number這點
個人其實並不需要一致
反倒 Foucs應在看study的model跟mechism上
這邊就先提個 tumor research 的幾個重點 不外於下面的幾點
1. Proliferation
2. Invasion
3. metastasis
當然除了這3點 還有一堆 有的 沒的
ex: angiogenesis.hypoxia.adhesion molecule.coagulation....
不過 請注意到一點 tumor的可怕 不在於他的生長大小跟速度
而在於他的術後再發生率(此點與metastasis習習相關)
如果只是在原位生長 那樣tumor disease就沒那樣的另人恐劇跟束手無策
[說個玩笑話.tumor不轉移.有tumor就動動刀拿掉就好了.少1隻腳總比少了一條命好 ^^ ]
拉回重點: sc & iv injection
s.c. model: 這邊看的大部份在於tumor如何在皮下proliferation.adhesion.
angiogenesis.invasion for transmigration to blood(後期)
i.v. model: 主要focus在 metastasis and coagulation adhesion and locatization
一般的tumor都是原位生長到一定大小 進而invasion到血管淋巴細統
造成無法完全治癒最嚴重 所以 因此一般的皮下注射量多 是因為一方面
s.c的injection 原位增生.養份需等到angiogenesis完成後(增生血管足夠提供tumor養
份)tumor才可以長到一定大小去侵入血管 進行轉移 當然一般文獻注射量多
還是需要考慮到該細胞本來的生長難易成度 及是不是想同時觀看轉移等等因素
如果是i.v. injection 生長的問題就比s.c單純多了
(增生血管要做什 還不是提供養份 ) 不知道這樣的解釋
能否提供妳對皮下注射量需大於i.v注射量的理解
不過就我個人意見 這兩個study的方向不同 細胞數相不相同 就不是那樣重要
但是每個人culture的細胞都有自己的生長速度,
所以其實我都是先用一定量 去抓幾天可以看到結果
,再反過來控制細胞量的多寡 讓我可以在預期時間去做實驗
分享一下 我以前打的劑量:
(1) iv: 5 x 10的 4次方 到3x10的5次方 就很足夠 14天就可以在lung看出tumor
(2) sc: 3~4 x 10 6次方 20天 觀察tumor皮下的 growth rate
(3) solution的量: 我都控制在80~120ul 通常我都用100ul
這點 我覺得200ul的確是上限 原因:
一隻小鼠的血液量約在1.5~2.3ml 如果妳一次超過總血量1/10以上的
dilute 會對mice產生蠻大的影響在 blood system
但以前我在練習tail vein injection 一次打1ml的Saline是沒問題的
所以原po可能在injection 可以再下點功夫改進一下
個人經驗上,建議控制100ul真的是差不多了
至於細胞濃度上 應該是還好 我也有打過7次方
應不致於thrombosis跟對老鼠有太大傷害 反倒是i.v打進去時
注意一下soln.溫度 太冰 老鼠會馬上卦給妳看
(4) 有沒有injection應該是不難看出 如果是尾巴 可以在打進去的瞬間看到
尾巴變白 血流會通過 但是妳如果是打B6就 觀查上有點難度
通常還有一種是利用眼窩靜脈叢注射 我比較喜歡那種打法
因為B6的尾巴不好打
(5) 關於針頭大小 是否會影響存活率 我有做過實驗
18G.26G.跟30G 其實並不會影響 我建議用一般1CC針筒附的那種
應該是26G罷 就足夠了 30G 感覺上 阻力大多了
(6) 關於PBS跟normal saline 其實如果練習上來講 不建議用PBS
實驗的經驗上 PBS比起saline 老鼠似乎有時會因為打PBS而卦點
或許是 因為鹽類的影響 所以 可以注意一下
(7) assay sc: growth rate/angiogenesis(matrigel)/hypoix/adhesion...
iv: coagulation /CBC/ organ IHC / anti-tumor drug..
第一次在板上分享了這些實驗經驗 希望對原PO有所幫助
如果有問題 也歡迎mail給我 或許可以提供妳意見
不過真的是太久沒做那方面實驗 有些東西都忘了
有記起來再補上去
以下有2張我以前做的圖片連結 給妳參考一下
http://www.flickr.com/photos/22868929@N03/?saved=1
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