[求救] 請教關於EMSA的問題
請問各位有在做EMSA的大大們
我用Roche DIG的系統 自己label的probe大約150bp
(這段序列缺少 在我報導基因的數據中 是活性下降最多的一段)
(用這段去做EMSA 有看到binding band 而且加unlabel 也能被競爭)
所以我去預測上面的TF結合位 然後合成幾組短短的oligonucleotide
annealing後 在binding的反應中 分別加進去當作competitor probe
lane 1: DIG-probe(150bp) only
lane 2: DIG-probe + nuclear extract
lane 3: DIG-probe + nuclear extract + competitor probe(沒有label)
.
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lane X: DIG-probe + nuclear extract + competitor probe X (沒有label)
結果出來 原本lane 2有band的地方 在加入X後 band就消失了
顯示 X的序列 好像是band 結合的主要位置
於是我將X的序列 做了點突變 然後照樣合成短短的 competitor probe X mut
再做一次EMSA 發現lane 2的band又出現了
(也就是lane 2 有band ; 加X後 band消失 ; 加X mut band又出現)
那麼請問一下 如果做到這邊 能否代表 X 就是調控這段活性主要的TF ???
將來如果去做 X 點突變的reporter construct 那活性是不是就會下降??
誠心請問有相關經驗的人 能分享一下
(>_<非常緊張這結果代表的意思 到了睡不著覺的地步了 T_T)
此外, 我跑出來的band 看起來都糊糊的 沙沙的感覺 @@
不知道是哪邊的問題呢？
先謝謝大家看完 ^^
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