Re: [問題] 向中研院購買的shRNA

看板Biotech作者 (自由 呼吸 存在)時間18年前 (2007/10/05 00:02), 編輯推噓2(2推 0噓 1→)
留言3則, 2人參與, 最新討論串2/2 (看更多)
※ 引述《driws (自由 呼吸 存在)》之銘言： 抽向中研院購買的shRNA的plasmid是否有特殊的技巧? 我用Quiegen的mini prep kit抽了好幾次 養小量抽3 c.c菌液最後用30 uL的水去elute 但幾乎出抽不出來...濃度低到只有0.05~0.06 ug/ul 過程十分小心 260/280的比值竟然高到3甚至4 以前抽plasmid從來沒有過這樣的問題 請問有經驗的前輩該如何改進 謝謝回答 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 140.116.60.163
推
10/02 13:29,
寫信去RNAi cortism問!
10/02 13:29
推
10/02 13:45,
你是用TB養嗎
10/02 13:45
推
10/02 14:00,
這個shRNA的菌好像都長的特別慢就連塗plate時也是長超小
10/02 14:00
→
10/02 14:03,
所以養的時間比較久才會抽的比較多 我用LB 5ml 養20小時吧
10/02 14:03
推
10/02 15:15,
我是用LB養 我塗plate的時候長的很小顆但是很多 塗太多嗎?
10/02 15:15
→
10/02 15:17,
所以養小量要抽到5 c.c 才會有正常的濃度囉...
10/02 15:17
推
10/02 18:29,
要用TB以300rpm養17-19小時,建議值是3倍稀釋OD600=0.4-0.6
10/02 18:29
→
10/02 18:32,
我是抽5ml,回溶20ul
10/02 18:32
推
10/02 22:34,
如果是low copy的plasmid就會較少量，長度較長可加熱再elut
10/02 22:34
謝謝大家的意見 :) 我後來又挑了五個clone養下去 今天抽小量順利的抽出來了三個clone 260/280都在1.9上下 濃度也有0.4了 參考大家的意見以及實驗室現有資源的考量下 我最後採用的方式是 用LB 250rpm養14~15個小時抽5c.c最後以70度的熱水30 ul elute 如果可以用TB的效果一定更好 當初買來就是這麼建議的 但是礙於實驗室沒有 老師也不是很有購買的意願... 另外不知道為什麼 我養20個小時相對於15小時 同樣5 c.c抽起來的反而比較不好 有學姊跟我說可能是因為這個vector很大 大約有6K 養的太老 E.coli 會傾向把這個外來的plasmid推出去所以會比較差一點 不過依舊是比原來的condition好多了 再次感謝~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 211.74.96.252 ※ 編輯: driws 來自: 211.74.96.252 (10/05 00:03) ※ 編輯: driws 來自: 211.74.96.252 (10/05 00:04)
推
10/05 00:46, , 1F
實驗室沒有TB的意思是沒有現成配好的TB配方嗎？假如有那些材
10/05 00:46, 1F
→
10/05 00:47, , 2F
料，可以自己配製呀！適用的medium可使你事半功倍～
10/05 00:47, 2F
推
10/05 23:03, , 3F
plate用LB可 長菌要用TB PLASMID quality才會好
10/05 23:03, 3F
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文章代碼(AID): #171GwG2g (Biotech)
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