Re: [問題] Real-time PCR的三重複

看板Biotech作者leondemon (狗狗)時間18年前 (2007/09/10 23:59)推噓3(3推 0噓 5→)

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※ 引述《xp1000 (acraft)》之銘言： : 小弟不是前輩但是我有不同的看法 : 不冗述但就leondemon所提到的SyBr Green方式 : 一般在螢光偵測上似乎一直為人詬病 : 相對於Taqman 它的三重複似乎更應該跟您朋友的方式一樣那樣做 : 取螢光偵測平均值減少3well之間的誤差 : 在統計上的意義 : 小弟個人淺以為 : 執著於同一個體上基因的實驗三重複性的重要性 : 遠不及在多個個體取樣後得到具再現的實驗結果 : 假設針對實驗個體上某基因因特別因素而造成的表現改變 : 使用您朋友的方式應該效率是較高的 : 因為若要在cDNA or RNA上取sample所可能造成起始濃度的問題上計較 : 那麼在更前面階段的分光光度計偵測就可能造成整體濃度計算的誤差了 : 根本的弔詭在於您的實驗組與對照組承擔一樣的取樣時的誤差風險 : 但是小弟絕不是否定您的方式 : 若能在個體三重複上及多個體的再現取得的統計意義 : 肯定是更不能否定的數據十分謝謝X大的回應我也呈述一下我的看法在我的原來文章中並沒有提及「統計」這個領域事實上統計本來就是需要大量的「樣本」去減少誤差 (樣本當然越多越好) 但是我所敘述的「三重複」並不是去用「統計」去看待而是用「分析化學」的角度因為我們正在討論的是「一個個體(individual)的測量」而非一個樣本(sample)的分析統計學上由於族群(population)代表著實際情況但我們不可能針對整個族群做研究 (想想看地球上有多少人類怎麼可能為了一個人類實驗而為每個人都做測量) 因此有了樣本(sample)的觀念目的就是希望能夠用少部分的數量去代表整個族群當然取樣(sampling)的好壞就會直接影響這個「樣本」是否真實反應原始的「族群」而「樣本」中每個基本組成單位叫做個體(individual) 我們會針對每個「個體」去測量我們要的結果講到這裡我要先說聲抱歉在我原本的文章中並沒有清楚的表示我說的是一個「個體」 (似乎在我原始的文章是講「一個sample」若造成誤會請見諒) 因此我要表明的一件事情我們今天是針對一個「樣本」中的「個體」做三重複當然也是可以用到統計的概念去針對這三次的結果做判讀但是我認為這實屬分析化學的域疇因為我們今天做real-time PCR 目的就是要賦予這個「個體」一個「量化」的結果因此最重要的我們側量它就必須考慮到測量的「精確度」和「準確度」當給予每個「個體」產生一些「量化的結果」後我們才會針對這個「族群」的所有個體進行統計上的分析去看有沒有差異但是各位是否有考慮過針對每個「個體」進行的測量結果是不是就是反應這個「個體」的狀態呢????? 因此我說三重複是分析化學的領域就是這個道理當你只取一次出來做實驗雖然是取三倍量並分裝至3個well中去測量這樣是提高了精確度這並沒有錯~ 但是你卻忽略的最重要的一點－－你並沒有說明「準確度」事實上，準確度想當然是比精確度來得重要許多不然妳測量的在怎麼精準但卻不準確也是枉然以統計的數據來說常常會看到的數據如: A±B A指的是平均 B通常指標準差而在分析化學中 A的意義就是準確度而B的意義就是精確度試想一個5公分的筆用一把尺去測量三次結果得到的結果是4.00 4.01 4.02 假設將結果記成 4.01±0.01 但是用同樣一隻筆卻是用三把不同的尺去測量結果得到4.6 5.0 5.2 假設將結果記成 4.9±0.3 由上面的結果第一種測量方法的確「很精準」每次測出來的結果都很一致但是「準確度」呢??? 已經錯得太離譜了而第二種的測量方法精確度的確不是很高但是「準確度」絕對是比第一種好太多我只能說一個測不準的方法或儀器即使在精密也沒用我們看結果通常是先看前面的數據也就是平均值也就是代表著準確度接下來才去看它的精確度如果本末倒置那科學的意義何在?? 今天我說的三重複就是要避免剛剛例子中「拿錯誤的一把尺，做多次測試」試想你只針對reagent做一次抽取要如何表示你結果的準確度呢?????? 如果這次你使用的tip有問題如果你這次pipetting有問題如果不小心抽到些微的氣泡導致取樣的體積不準確.... 太多太多的如果了分生實驗根本看不太到你現在tube中有哪些成分多少體積若是把reagent包裝外面的標籤撕掉我想根本沒多少人能夠從一群未知reagent中去做PCR 又不是像動物實驗大的用眼睛一眼就看得出來顏色、大小、位置....之類的狀態描述那「分子階級」的東西你怎麼有把握你做的就沒問題?? 你要怎麼確認?? 這就是我所認為的「三重複」存在的意義我只是針對X大所提的觀點做回應事實上我並不同意X大的觀點而不論是Taqman或是SYBR green方法我認為都是一致而X大所提及分光光度計一事我只能說那就是internal control必須存在的意義最後要說的一個實驗的測量若是儀器部分的誤差那就是人為無法避免的事實上一個儀器的精確度和準確度應該是該儀器所「必須」具備的照理來說我們應該做同一個實驗都使用相同的儀器 (如果有人想回:「既然要三重複，那應該用不同的儀器去做測量。」那我就不想跟你瞎起鬨因為我說過了一台儀器的精確度和準確度是該儀器所必須具備的) 然而人為的誤差這就是實驗者應該去避免並且該去證實的那........何謂「三重複」? -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) ◆ From: 61.229.164.243

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