Re: [問題] Real-time PCR的三重複
※ 引述《leondemon (狗狗)》之銘言：
: 三重複的意義何在？？？
: 為什麼要做三重複？？？
: 三重複要怎麼做？？？
: 最近因為這個問題，跟我很在意的人鬧得有點不愉快
: 因此想聽聽這邊的前輩的解答。
: 我說說我的看法。
: 我覺得三重複的意義，在於要確定每次的做出來的結果是一致的。
: 應該說，任何實驗，都要確定其「再現性」，才能說這個結果是有意義的。
: 因此，我有看過講究一點的paper，他們有測試同樣的reaction在不同時間上機，
: 來確保機器在不同的時候上機，其結果會有差異。
: 而我覺得三重複的配法，應該是要除了cDNA以外的reagents先混合配好加入各well中，
: 然後再取三次cDNA，分別加入三個reaction中，證明每次取的cDNA都能做出一致的結果。
: 因為PCR反應中，cDNA的初始濃度，應該是影響結果差異的最主要原因，
: 所以針對cDNA做不同的三次加入的三重複，來確定人員沒有操作失誤，
: 而除了cDNA以外的reagents先mix在一起，是要做到「在相同環境下，測試一個可能變數」
: 所以如果做出來的擴增曲線是重疊的，那表示三次的操作都沒問題，
: 若是有一條沒重疊，表示那次的pipetting可能有問題，於是排除該數據；
: 若是三條都沒重疊，則表示結果不一致（無再現性），因此該組數據都不能用。
: 上面是我的看法，但是我聽到有人的三重複作法跟我不同。
: 他們是將所有的試劑混合在一起，這包括了cDNA、primer、和SYBR GREEN master mix，
: 混合好後，直接分裝到三個well中，然後跑出來的擴增取線很完美的重疊。
: 可是我卻覺得這樣做已經失去了「三重複」的含意，
: 只是為了做「三重複」而做的「三重複」。
: 因為他們從tube裡面只取了一次cDNA到整個mixture中，
: 這樣的三重複，就不能證明，「下次再做一樣的實驗，擴增曲線會是一樣的情形」
: 因為他們沒有做「不同次數抽取cDNA時，其擴增曲線是一樣的」
: 畢竟cDNA的初始濃度稍有不同（可能是pipetting或人員操作技術導致），
: 其結果可能就會有明顯差異。
: 我覺得他們那樣的作法，只是把「同一個reaction，在同一台機器上跑三次」
: 能證明的，頂多只有「這台機器很穩定，因為在不同的well位置，其熱循環結果一致」
: 可是要證明這個做什麼呢？ 這不是這台機器「基本」應該具備的條件嗎？
: 對每個reagent只有做一次pipetting，那要如何表示這個反應的「再現性」？
: 根據我的實驗經驗和speciallist的指導，
: 要降低cDNA的pipetting error，最好的方式就是先稀釋整個cDNA來源，
: 充分混合均勻（vortex & spin down）後，再取cDNA加入各reaction中。
: 這樣可以使原本可能只要加 0.5 ul的cDNA，變成加入 5 ul（因為cDNA稀釋10倍），
: 這樣pipetting時，一些的些微誤差，會因為取的體積變大而降低變異係數（差異百分比）
: 我想聽聽看各位前輩對這兩種三重複作法，有什麼樣的見解？
: 哪一種方法是正確的？ 還是兩種都正確？
: 謝謝～
小弟不是前輩 但是我有不同的看法
不冗述 但就leondemon所提到的SyBr Green方式
一般在螢光偵測上 似乎一直為人詬病
相對於Taqman 它的三重複似乎更應該跟您朋友的方式一樣那樣做
取螢光偵測平均值減少3well之間的誤差
在統計上的意義
小弟個人淺以為
執著於同一個體上基因的實驗三重複性的重要性
遠不及在多個個體取樣後得到具再現的實驗結果
假設針對實驗個體上某基因因特別因素而造成的表現改變
使用您朋友的方式應該效率是較高的
因為若要在cDNA or RNA上取sample所可能造成起始濃度的問題上計較
那麼在更前面階段的分光光度計偵測就可能造成整體濃度計算的誤差了
根本的弔詭在於 您的實驗組與對照組 承擔一樣的取樣時的誤差風險
但是小弟絕不是否定您的方式
若能在個體三重複上 及多個體的再現取得的統計意義
肯定是更不能否定的數據
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