Re: [求救] 植物DNA的萃取
※ 引述《odones (天空)》之銘言：
: 最近要抽植物的Genomic DNA
: 可是一直不順跑電永都是smear的情況
: 把protocol列出來希望有大大可以給予指教
: 謝謝
: 1. CTAB 500贡ul ＋ beta-me 40 ul 預熱65℃ 30 min
: 2. 液態氮研磨植物葉片加入（1）水浴65℃ 2 hr
: 3. 加入chloroform/isoamyl 24：1 500汹ul，倒轉tube 100次，離心8000 rpm 10min
: 4. 吸取上清液到新tube，加入chloroform/isoamyl 24：1 500 ul，倒轉tube 100次，離心8000 rpm 10min，共三次
: 5. 加入isopropanol 500ul，放至-20℃ overnight
: 6. 離心8000 rpm 10min，4℃，去上清液晾乾
: 7. 加入TE buffer 500ul 彈至全溶（tip可切斜口）
: 8. 加入RNase 5汹ul，37℃ 30min
: 9. 加入isopropanol 500 ul，放至-20℃ 30min
: 10. 離心8000 rpm 10min去除上清液
: 11. 70％酒精wash 2次，晾乾
: 12. 加入TE buffer 200 ul，測OD，跑電泳
1.你在把研磨好的植物材料放到CTAB時,可能潮解到 (我初期做實驗時有發生過)
2.會不會你的植物材料的次級代謝物太多,遮光不足等 (像我的材料會額外加入PVPP)
3.水浴的時間....我是不清楚你是看paper還是前人留下來的方法...我是覺得煮太久了
4.我建議你再第7步驟後再細純化一次利用phenol與chloroform...
因為我覺得你這個純化方法算是粗純化而已...在最後的DNA中仍存在許多雜質~如蛋白質
5.（tip可切斜口）<-----這個步驟很危險...原本滅菌好的tip..可能切的動作污染!
6.你可以將RNase作用時間再延長至1個小時...讓他充分作用
7.我想最終還是你的TE buffer是不是已經污染等等~
其實再第一次TE buffer溶完時,就可以先跑一次電泳...
如果這時候已經smear就知道之前步驟出出問題了
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◢ ◣ 吼～
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推
07/29 14:02, , 1F
07/29 14:02, 1F
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