Re: [問題] live cell image??
※ 引述《cytospin (My Ernest)》之銘言：
: 各位先進好
: 小妹最近開始想做confocal
: 得到的資訊大多是fix細胞的步驟
: 可是我想要做那種看到protein internalization然後被derade掉的
: 所以要做活細胞影像
: 不過有幾個問題 想問一下有做過的人
: 我的細胞是suspension cell
: 我想看的是cKit (RTK) mutant 他會自動林酸化然後turn over
: 加藥物之後 cKit會不穩定然後 cKit expression就消失了(on western)
: 想請問一下 1. 活細胞影像的fix 還有打洞 使用的Material ??
: 如果是fix的細胞 是4% paraformadehye + 0.5% Triton X100
: 活細胞要用啥ㄌㄟ ?? 又不會弄死細胞又可以intracellular stain的
: 2. 如果我有抗體bind cKit -->會不會影響他internalization??
: 我不清楚我的抗體會部會block cKit function yet...
: 先這樣..感恩....請各位先進給點意見
(碩一時做過一陣子suspension cell的live image 吃了些苦頭:p)
就印象所及
細胞fix再打洞後 要活著似乎有點難度
建議可以查一下paper是否有人做過類似的實驗。
另外一點是confocal
如果你要給細胞一個可以快樂發揮應有function環境
觀察時要有足夠的medium，適當的溫度，當然能提供CO2是更好的！
而可能需要檢查一下你所使用的confocal是否具備能外加這些裝置的條件。
(為了不要讓共軛焦的雷射光源過熱，顯微鏡室的冷氣會很強，根據我的經驗，
細胞一冷，就不理你了....T__T)
suspension cell由於不會很緊密的貼附在盤子或是玻片上
所以 再調焦距的時候會有點難度，也很容易跑掉，
在拍image的時候 人最好要隨時顧在機器旁邊～
(可以試著在玻片上coating fibronectin或是cortactin，有些細胞會有不錯的效果!:))
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※ 編輯: JeffreyS 來自: 123.193.28.105 (05/05 17:50)
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