Re: [求救] cloning求救...一直做到怪東西阿
※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之銘言:
: 從事現在在clone的蛋白已經快2個月了...
: 一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了
: 請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題...
: 以下是實驗步驟及結果
請問你純化出來dna的體積是多少,你又load了多少體積的DNA?
1:5的比例我覺得是錯的,因為從你的圖看起來,insert跟vector的亮度差不多,但是
要記得,越大的fragment抓到的EtBr會越多,所以雖然看起來亮度差不多,dna的量其實
差很多。你應該要將亮度的比例除以分子量的比例。
舉例來說,你的兩個band看起來是1:1的亮度(insert:vector)分子量的比例,大約是
500:5000=1:10。這樣一除,莫耳數比就大約等於1:0.1=10:1,也就是說,在相同體積
裡面,insert的莫耳數是vector的10倍。所以,如果你要調到5:1(i:v)的話,取得體積比
應該是1:2 (i:v)。
所以你5:1(i:v)的比例是錯的。你這樣取,試管中實際的莫耳數比是50:1 (i:v)。
在這種情形下,過多的insert會與vector結合,這會造成一個vector與兩個insert
結合,也就是說,用A enzyme切過的那端抓了一個insert,用B enzyme切過的那端也抓了
另一個insert,然後兩個insert的另一端分別是A與B enzyme的切位,自然就接不起來。
在這種情形下,你挑到的菌應該就是隨機亂接或是rearrangement的結果。看你只挑
了四顆,是不是因為只有長四顆呢?
最後,看你的insert與vector大小的比例,1:5太多了,大概1:3就差不多了。1:5我記得
是當你的insert與vector大小差不多的時候才需要用到。
試試看吧,如果你原本就有除過分子量才去做ligation的話,就當我沒說過囉~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 220.130.218.41
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容:
完整討論串 (本文為第 5 之 6 篇):