Re: [求救] cloning求救...一直做到怪東西阿
※ 引述《ssuny (Cheer up!!!)》之銘言:
: 從事現在在clone的蛋白已經快2個月了...
: 一直沒有好的結果...本人做到都快沒信心了
: 請各位版友好心幫個忙吧...幫我看看到底是哪裡的問題...
: 以下是實驗步驟及結果
我特別去查了一下pET32a plasmid map.....
我發現到一件事.....你可能要換restriction enzyme才能做出來.....
原因如下.....
在pET32a map上...Hind III的位置在第173bp而Sal I的位置在第179bp
map上的序列如下:
Sal I
------
------------AAGCTTGTCGAC----------
------
Hind III
你說你pET32a是用Hind III + Sal I cut
在此幫你建立一個觀念.....鄰近的兩個enzyme最好不要一起用
因為當你其中一個enzyme作用時會導致另外一個enzyme無法作用
舉例來說: 假設Hind III先作用 作用完後linear plasmid會變成以下情形
Sal I
------
-----A AGCTTGTCGAC--------
-----TTCA ACAGCTG--------
之後,當Sal I準備要作用時, 請你注意一下
在Sal I cut site的左邊(5'端)只剩下一個base pair
這種情形大多會影響下一個enzyme的作用力....嚴重的話會讓他無法作用....
所以, 你說你pET32a是用Hind III + Sal I cut......
實際上, 卻只是pET32a用Hind III or Sal I cut......
你的clone一定會做不出來............
你試著換另一種enzyme....兩個enzyme距離遠一點(至少要離3~6 base pair以上)
不同的enzyme所需要的距離也不同, 如何查到這種資訊?
你可以去翻NEB給的catalog......
在最後的附錄地方..給了很多restriction enzyme的information....
包括在primer上加restriction enzyme旁邊需要留多少base pair作用效果才會好...
oligo-DNA上(例如linear plasmid)旁邊要留多少base pair作用效果才會好...
等等......
這些資訊都可以查的到.......
ENB catalog是一本不錯的工具書(對常做sub-cloning的人而言)....
對於你的問題....我相信你只要將其中一個enzyme換掉...應該就可以解決....
希望你順利....
Best.....
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.109.228.183
推
12/28 02:19, , 1F
12/28 02:19, 1F
推
12/28 02:48, , 2F
12/28 02:48, 2F
推
12/28 09:13, , 3F
12/28 09:13, 3F
推
12/28 11:17, , 4F
12/28 11:17, 4F
推
12/28 11:58, , 5F
12/28 11:58, 5F
推
12/28 13:48, , 6F
12/28 13:48, 6F
推
12/28 15:31, , 7F
12/28 15:31, 7F
推
12/28 21:30, , 8F
12/28 21:30, 8F
推
12/29 00:17, , 9F
12/29 00:17, 9F
討論串 (同標題文章)
本文引述了以下文章的的內容:
完整討論串 (本文為第 2 之 6 篇):