Re: [問題] confocal樣本處理
※ 引述《paua (waiting for good news)》之銘言：
: 我染PI出現兩個問題,
: 麻煩請幫我看圖中紅色的部分, 謝謝 ^^
: 這是以前染的fibroblast, 是成功的 http://tinyurl.com/y9jpnb
: 問題一 相同種類細胞, 但是染到細胞質, 且核部分不明顯 http://tinyurl.com/ygtgfb
有可能是染劑未完全進入標地位置以及未沖洗乾淨(撇開您細胞質紅色影像為其他抗
體之紅色螢光)。此張影像似乎有過飽和的感覺(背景都是綠的，理論上應該是黑色)
建議：
染完後用PBS多洗幾次，此外PI是鑲嵌於DNA雙股中。另外細胞質內有mitochondria
，其也含DNA，PI也會染到(一隻mitochondria有百個DNA copy)
: 問題二 不同種細胞(keratinocyte), 為什麼核中有圓圓區域染不到
: keratinocyte A: http://tinyurl.com/yc6g5g
: keratinocyte B: http://tinyurl.com/ycdpt8
: 是因為不同種類細胞而有的特徵嗎?
: 可是我實在想不出來那應該是細胞核的哪一個細部位置? 有些人說是核仁,
: 但核仁的顏色應該要比較深(紅), 不是嗎?
染有DNA的地方。你AB兩張拍到的是正常情況下confocal MS看到的PI結果
造成你問題一與二PI染色的結果不同，除了上述之外還有可能是機器操作的問題
雷射強度過強造成訊號過度飽和，pinhole開太大，雜訊過多都會造成細胞核染PI後一
團紅。依本人多年操作confocal MS經驗只有細胞核皺縮才會染到一團紅紅的。
改善實驗建議：
使用confocal MS 時pinhole盡量小，雷射強度也是。若訊號過低時建議先稍稍調高雷射
視結果再調pinhole。相信萊卡，蔡斯，bio-rad等品牌都有影像重複疊合最佳化的介面
(kalman等方式)，利用短時間重複掃描計算得到最佳影像。
: 我處理步驟都一樣(每個步驟之間都用PBS wash三次):
: 1. 細胞固定: 2% paraformaldehyde, 15min, RT
: 2. 打 洞: 0.1% triton X-100, 10min, RT
: 3. blocking: 1% FBS in PBS 1-2hr, RT
: 4. 染 一 抗: 這部分沒有問題, 暫不討論
: 5. 染 二 抗: 同上
: 6. 染 核 PI: 4ug/mL, 5min, RT
: 7. 封 片
一個曾經以玩confocal MS為興趣的過來人
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12/13 11:21, , 1F
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