Re: [問題] 如何計算RT的效率呢?
※ 引述《aggaci (學鋼琴，左手怎麼那麼笨)》之銘言：
: ※ 引述《hychou (布丁)》之銘言：
: : 板上的前輩們好,
: : 最近在進行RT-PCR,所用的RT為invitrogen的superscript III
: : RT前我先測了total RNA濃度後,以5ug RNA去RT (reaction vol.=20ul)
: : RT結束,我取1ul cDNA來測濃度, 100x稀釋 OD260=0.299
: : 其濃度計算是否為0.299x40x100=1.196ng/ul
40核醣核酸（RNA）的常數....不是單股的去氧核醣核酸
: : 這樣算的話cDNA不就有1.196x20=23.92ng @@(昏)
: : 請問前輩們,究竟哪裡出了問題?
: : 我用random primer來RT,應該不會有影響吧?!
: : 另外,這批RNA的ratio大概都在1.6左右,
: : 這樣是否會影響之後的real time PCR反應?
: : 我最煩惱的是standard curve是否會做不好?
: : 謝謝大家幫忙!!
: RT後的cDNA應該無法測cDNA濃度！
: 您想一下ribonucleotide測濃度原理即知
還是有讀值沒錯啊...只是一股是RNA...一股是cDNA....哈妙....
這係數會是多少？我真很好奇....不知有沒人知道？
基本上RT做的好不好.....是透過比較housekeeping gene啦
如果你幾次實驗跑下來Housekeeping gene的 Ct值都差不多...你就算RT高手了
其次，同一trial的standard curve怎做都很漂亮.....只要你的pipette不差
難在inter trial的standard curve........真的要練一陣子....不過這是
real -time PCR最難的部份....在你手法還不穩之前...別輕易下結論喔！切記
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◆ From: 210.58.54.177
推
11/21 11:03, , 1F
11/21 11:03, 1F
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