Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
※ 引述《Bluecold (黑特版比就可版好笑)》之銘言：
: ※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: : 講仔細一點我們的構想
: : 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
: : 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
: : 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
: : 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
: : 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
: : 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
: : 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
: : 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
: : 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
: : 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
: : 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
: : 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
: : 因此 fusion 的辦法似乎是不可行
: : 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
: : DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
: : 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
: : ubiquitin 結合的機制好像也不適用
: : 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
: : 也會任意的鍵結在一起
: : 有沒有知道其他方式可以做的阿
: : 還是這本身就是個很難的題目?...
: 嗯 那如果這樣呢
: 把兩個蛋白質的C-ter與N-ter接上一小段nucleotide
: 然後再用DNA ligase接起來....
: 不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出來用 如果可以的話
good idea 但是這有一個問題 (因為這方法我想過)
即便是兩各蛋白質成功接上DNA or RNA
再是利用ligase把他接在一起我認為可能性不高
1. DNA 或 RNA 不能過長 太長兩個 domain 就沒法子回覆一起
整各實驗就沒意義了
2. 太短 ligase 要接合兩段 DNA 或 RNA 中間不能有立體障礙的
但是兩各蛋白質本身就是各無比大的立體障礙
ligase 再反應時會被兩各蛋白質所阻擋 所以我認為機會不大
: 否則就分別分開兩個domain做labelling
: 然後用化學合成peptide的方式
: 把兩個domain以一級結構的方式合成 再篩選
: 不然在兩個domian的C-ter與N-ter各接上DNA/RNA
: 以及DNA/RNA binding domain然後丟在一起
: 好吧 我承認我是來亂的 可是這是我認真想出來的
化學合成peptide 的方式太過劇烈
在peptide bond 合成完前..我的兩蛋白質早以 denature
且越大越複雜的蛋白質越不好 renature..
另一個問題是 peptide synthesis 需要以t-Boc保護
amino group, 但是蛋白質本身不只有 N 端有amino group
像 lys, Arg 等表面上的胺基酸的 R gruop 都帶有 amino group
這些都會使反應 nonspecific
如果以一級結構的方式 solid phase 合成peptide 再結合在一起
那別說15 kDa 的蛋白質了
只怕 5 kDa 的蛋白質都無法合成出來
且以此合成效率 (越長越低)
final 不可能用以 NMR 來測蛋白質結構的 (NMR 測 protein 所需濃度極高)
不過 非常謝謝你的建議
希望您有更新一步的想法供我們做參考
Gratefully yours
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