Re: [問題] 如何將蛋白質結合在一起
※ 引述《timbrian (perk yourself up)》之銘言：
: ※ 引述《ROKEE.bbs@bbs.badcow.com.tw (死胖子超怕熱)》之銘言：
: : 將domain A與fish的gene做fusion
: : 將domain B與bait的gene做fusion
: : 然後將domain A-fish的部分先做modofication
: : 再將domain A-fish-M混在domain B-biat混和
: : 觀察有M和沒M的結果是否有差異......
: : 只是這樣透過一個中間物不知是否會對您的實驗需求有影響就是
: : 看起來像yeast two hybrid XDDDDD
: : 不然就...利用chemical reagent做partial modification吧
: : 控制chemical的濃度、反應pH、buffer,etc...
: : 印象中Cyanylation測disulfide bond的方式也是partial modification ^^"
: : (最近千面人很熱阿...XDDDD)
: 講仔細一點我們的構想
: 我們想研究一個蛋白質兩個 domain 的互相影響
: 目前這個蛋白質已經有結構 (X ray)
: 我們想看這兩個 domain 在動態下的結構改變
: 尤其是看其兩個 domain 如何細微的藉由結構的改變而調控彼此
: 兩個 domain 分別為 15 kDa 與 30 kDa
: 其中 15 KDa 的部份想用 N15 做 labelling
: 而 30 kDa 的部分不沒有 labelling
: 分別純化出來 看能不能再結合為 full length protein
: 再以 NMR HSQC 的方式只看其 15 kDa 的部份的結構改變
: 這個實驗設計為最大的盲點就在如何使兩個 domain 再結合回去
: 已知這兩個domain 中間有一個 linker 的部位
: 但是如何能專一性的將這兩個 domain 的 N端 與 C端接在一起就是個大挑戰
: 因此 fusion 的辦法似乎是不可行
: 所以在想有沒有其他方式可以結合這兩者
: DNA 具有 DNA ligase 可以結合 DNA 的 3' 與 5'
: 蛋白質好像就沒聽說過可以有 enzyme 結合 N 端與 C 端
: ubiquitin 結合的機制好像也不適用
: 化學 cross link 的方法會卡在蛋白質表面胺基酸的 side chain
: 也會任意的鍵結在一起
: 有沒有知道其他方式可以做的阿
: 還是這本身就是個很難的題目?...
嗯 那如果這樣呢
把兩個蛋白質的C-ter與N-ter接上一小段nucleotide
然後再用DNA ligase接起來....
不然就把23S rRNA的 aminoacyl-transferase活性拿出來用 如果可以的話
否則就分別分開兩個domain做labelling
然後用化學合成peptide的方式
把兩個domain以一級結構的方式合成 再篩選
不然在兩個domian的C-ter與N-ter各接上DNA/RNA
以及DNA/RNA binding domain然後丟在一起
好吧 我承認我是來亂的 可是這是我認真想出來的
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