Re: [求救] 質體設計是否有問題

看板Biotech作者Ianthegood (厭惹故)時間3年前 (2020/10/31 07:42)推噓17(17推 0噓 0→)

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※ 引述《nm768417 (opport)》之銘言： : 因為構築好的質體之後要來產蛋白 : 但小弟是新手，不確定這樣設計是否會有什麼問題 : 1.會有其他雜band出現嗎？ : 2.我的那段insert前面的T7 promoter因為離insert有點距離，所以我在設計insert的時 : 候， : 前面加了start codon，這樣會有蛋白做不出來的問題嗎？ : 3.圖中的insert大小是414bps，還有另外的是369bps，這樣在跑WB後，跑出來的結果是不 : 是會滿靠近的？ : https://i.imgur.com/Udqt0hS.jpg

唉還是來回一下好了也希望能夠幫到各位剛踏入protein expression阿鼻地獄的後進首先做bacterial (或是其他) expression最先要考慮的就是你最後這個蛋白要幹嘛這個很大一部分會限制你表現蛋白的方式跟策略舉例來說你需要做蛋白活性測驗阿你又不確定蛋白能不能refold 那可能你就得做native state purification, 意思也就是蛋白可能不能太小太soluble promoter可能不能太強 induction不能太熱 codon不能太optimised 不然可能全部會被推進inclusion body 換句話說你如果要做htrf 蛋白不需要太純那就隨便做沒差然後勒絕大多數的情況你蛋白都要純化純化有兩個層面一個是tag/chromatography 一個是competition 首先你希望你的蛋白有很好抓的tag或是特性再來你希望你的蛋白很多很多其他的雜蛋白很少很少越少越好所以才不會來跟你搶你的column或是純化方式嘛一般來講第一道純化一定還是雜還是要過第二道甚至第三道手續簡單過個gel filtration都好回來看原po這個例子第一個是你產蛋白要幹嘛做elisa/跑膠/跑2D/打老鼠的要求都是不一樣的再來為什麼要用pET32a 為什麼不用基本款的3a就好 32a的特色是他有一個N-ter的fusion thioredoxin可以幫助protein folding 通常你還得自己放一個切位上去純化下來之後可以把trx切掉阿你現在做兩個分開雖然前面有前輩講只要放個SD sequence上去細菌是polycistronic所以大概還是express得出來但是為什麼還要浪費資源去overexpress那個thioredoxin 大概還會比你的protein多到時候一定都沾在column上面拎北鐵口直斷然後你這兩個蛋白mw這麼近肯定gel filtration拉不開阿是不是又要再買column 唉最後提個小弟博班學到的畢身絕學跟各位分享做native state overexpression的話 pET32很不錯啦 trx-His6-TEV site-protein of interest 要自己純化TEV protease, addgene上就有超好用還內建histag一步純化但是如果還是不行還有大絕招用intein system, NEB的pTXB1/pTYB1 (addgene也有, 但是可能要自己clone) protein of interest-GyrA chitin column拉下來之後用DTT可以產生auto cleavage, 完全沒有scar 基本上超純濃縮desalt就好了給各位參考 -- 人好欠表 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 92.40.174.146 (英國) ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1604101334.A.0F5.html

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10/31 10:03, 3年前 , 2^F

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10/31 14:20, 3年前 , 3^F

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