Re: [求救] 基轉後農桿菌無法根除
※ 引述《stephilow ()》之銘言：
: 想請問一下，
: 我做植物的基因轉殖，
: 是用農桿菌感染的轉殖方式。
: 植物材料是桉樹跟菸草無菌苗的葉片。
: 感染後兩天葉片周圍會長出細菌，
: 我加入cefataxin和carbcillin清洗後，
: 發覺菌量會暴增，之後怎麼洗也很清除乾菌。
: 最後是菌量過多掩蓋葉片，然後葉片就爛掉死了...
菌量蓋過葉片就沒救了
: 請問有甚麼方法可以解決?(做了一年都沒成果)
: 如果是菌種汙染，有甚麼方法可以可以解決?
除非你很不幸又很衰被抗cefotaxim的菌汙染到，
不然聽起來比較像是葉片沒洗乾淨。
(你轉進去的construct應該沒帶抗cefotaxim基因吧)
: 謝謝
不知道現在回會不會太晚。
不知道你是怎麼清洗的，
我有聽過有人洗葉片是輕輕把葉片在無菌水上刷幾回，
好像涮涮鍋一樣，結果當然菌一直長 XD
以下是從前實驗室的韓國博後學來的，
我自己獨立做菸草轉基因，基本上都有一定的成功率。
一樣也是感染後48小時把葉片拿出來洗，
每一組準備約350 ml的無菌ddH2O (dH2O應該也可)
另外準備乾淨滅過菌的250 ml錐形瓶，
(所以要事前把錐形瓶蓋鋁箔封口，滅菌，放涼)
把葉片從培養基拿出來，放進錐形瓶，倒入約100ml無菌水，
用力搖晃或是vortex十多秒後水變混濁，倒掉，
(請善用你的鑷子把葉片留在瓶口)
接著再倒入100ml無菌水，
重複用力搖晃或是vortex十多秒後水變混濁，倒掉，
接著再倒入100ml無菌水，
一樣搖晃後倒掉，理論上第三次的水應該相當清澈。
把葉子取出，放到無菌的濾紙或無菌擦手紙上晾乾，
接著再把葉子放置於regeneration medium.
Regeneration medium放cefotaxim 是必備，
不知道你培養基cefotaxim放多少，
我看過有人放250 mg/L, 也有人放500 mg/L,
我自己比較常放500 mg/L，毒不死菸草的，你也可以試試看。
另外切記cefotaxim的作用更接近抑制菌的生長，而非殺菌，
加上抗生素活性會隨時間衰減，
請記得每3-4週就要換一次培養基，最好每次培養基都加cefotaxim,
直到長出來的小苗移進土壤為止。
(這也是為什麼有些人認為轉基因菸草丟棄前應該整株Autoclave)
另外regeneration如果有那麼一片leaflet有農桿菌長出來，
請果斷把那片leaflet及周圍培養基一併挖除，像切除腫瘤一樣。
以上希望有幫到你，有問題歡迎回文。
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 68.203.70.186
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1517639992.A.039.html
推
03/09 16:24,
6年前
, 1F
03/09 16:24, 1F
討論串 (同標題文章)