[求救] commasie 染色後的蛋白lysate沒有band

看板Biotech作者 (阿亮)時間7年前 (2017/07/27 23:34), 編輯推噓3(3推 0噓 30→)
留言33則, 4人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
請問各位，小弟收取10^7的陰道鞭毛蟲，使用lysis buffer(4%CHAPS,8M urea)後，離心 取上清液測蛋白濃度有30mg/ml，之前以4倍稀釋劑跑膠，染完commasie blue 後，得出的 結果竟是如圖一樣，完全沒有banding，而是smear一條一條，這樣是正常的嗎？ http://i.imgur.com/Q5mxKYR.jpg
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07/27 23:37, , 1F
正常來說總蛋白lysate去跑應該要有一條條各種大小蛋白
07/27 23:37, 1F
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07/27 23:37, , 2F
的band吧？ 我這樣是因為沒有破細胞破完全嗎？
07/27 23:37, 2F
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07/28 02:38, , 3F
可以錯的地方很多 細胞 lysis page coomassie
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07/28 02:39, , 4F
每一步都要有control
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07/28 09:01, , 5F
細胞指的是太少嗎？ lysis buffer我是照著學長給的配
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07/28 09:01, , 6F
需要sonicator打破嗎？ 膠的部份應該沒有問題 正常的配
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12%膠 染色我染10分鐘後就多換幾次清水...
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07/28 17:57, , 8F
"control"
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07/28 17:58, , 9F
旁邊跑一個新鮮的bsa就知道問題在哪一端
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07/29 10:58, , 10F
07/29 10:58, 10F
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我用我之前的純化蛋白跑在旁邊，這樣代表什麼呢
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07/29 14:39, , 12F
看起來膠跟染劑沒問題，靠近marker的sample隱約有淡淡的band
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07/29 14:41, , 13F
可能是蛋白質量少(細胞破裂程度不夠，或細胞數量太少)，不過
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07/29 14:42, , 14F
有時候在WB，經由抗體抗原結合+放大效應，會有比較明顯的band
07/29 14:42, 14F
推
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可考慮用濃度較高的sample跑膠，若lysis buffer不會干擾跑膠
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07/29 14:46, , 16F
甚至可以不要加稀釋液
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07/29 19:31, , 17F
如果是破細胞破不完全，會測的到30mg/ml這樣的濃度嗎？
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07/29 19:31, , 18F
那如果這樣是不是要用sonicator再破會畢較好
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07/29 22:38, , 19F
我不了解陰道鞭毛蟲特性，無法判斷您lyse cell過程是否足夠，
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07/29 22:40, , 20F
加入lysis buffer後sonicate或其他增加蛋白質暴露的方法都值
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得一試，要注意溫度或其他條件，避免蛋白質遭受破壞。您用
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07/29 22:44, , 22F
urea，需先確認是否會干擾蛋白質濃度測定試劑，是否有偽陽性
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的問題存在?
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07/30 10:30, , 24F
我是使用nanodrop測定，並以lysis buffer做為blank
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會不會是有可能蛋白都degrade了，斷了，但仍然測的到高
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07/30 10:31, , 26F
濃度
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推
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吸光值不太準 用Bradford定量看看
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07/30 13:43, , 28F
我也使用braford試過了 確實有這樣的濃度
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08/02 14:29, , 29F
我使用sonicatorhttp://i.imgur.com/Rya8ioU.jpg後的跑
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膠結果
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08/02 14:29, , 31F
這樣算正常嗎？
08/02 14:29, 31F
推
08/02 16:23, , 32F
比較好一點囉 看來是本來你的蟲的expression就比較平
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08/02 16:23, , 33F
淡一點沒什麼特別高的gene?
08/02 16:23, 33F
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