Re: [求救] NRK52E West Blot actin飆高問題

看板Biotech作者Ianthegood (厭惹故)時間7年前 (2017/05/02 01:55)推噓2(2推 0噓 6→)

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認真回「定量」 ---------------- 一般「定量」的意思是把一個sample mixture裡面的全部的蛋白或是單一一種蛋白species的量給定出來。定total protein的量通常有幾種方式，最常用的有qubit還有好幾個呈色法，包含bradford，BCA, lowry等。 qubit受歡迎的原因是因為你只要把東西混一混丟到機器裡機器就會跟你講你這裡面有多少protein。其他呈色法都需要你用已知濃度的standard去拉standard curve, 做出function後才能換算你的sample的濃度。根據你的吸光值測的波長我猜你用的是bradford。你拉出standard curve後就可以算你的R^2，這個數字代表你的standard curve拉得多好多漂亮，你如果拉出R^2=1的曲線就可以到處跟人家說嘴說你的手超穩 standard多純kit多好之類的。你的sample透過這個curve的function代入y之後就能得到你的protein濃度->這才是你最重要的數字。如果是真的用elisa定量的話也是類似的道理。elisa是透過免疫反應來定單一一個 protein species的量，理論上只有你的protein會被抓住, 其他的蛋白都會被洗掉，最後再透過再一次抗體辨識後, 二抗上面的酵素一樣可以作呈色反應，一樣可以用 standard拉standard curve，一樣有R^2, 一樣要拿你sample的吸光值去fit你的 curve。最後會得到你的原本sample裡面某個特定的protein的濃度。 western blot --------------- Western blot 也是透過免疫反應來定一個特定的protein的濃度(其實只能說是半定量)。不同的是你的blot這時候同時還給了你關於這個 protein的大小的資訊。最常見的方式你的抗體上面會接HRP, 發出冷光, 在底片上曝光，這個資訊最後轉換成一條band的大小及粗細。理論上你也可以去用已知濃度的該蛋白拉standard curve不過由於這種蛋白比較不好取得加上western blot先天的因素, 一般只拿來看趨勢而不拿來做精確的定量。通常會另外再壓幾個housekeeping gene當作control。一般壓western有幾個先天的pre/assumption。你每個well的loading量一樣。這個意思就是你預期每個well裡面放不同處理的同樣數量的細胞/sample，所以你才可以用同樣的control來決定你現在要看的protein到底是比較多還是比較少。這個背後又隱含了另一個asumption那就是不同的sample表現你的control gene的量是差不多的, 具體化一點就是，不論代數，你的每顆細胞應該會有差不多量的actin 跟GAPDH。這個不成立的話你根本沒有辦法拿control來當作基準做比較。透過定出protein的濃度來決定每個well要放多少sample這個動作叫做 standardization。非常重要。然後是細胞代數。我沒記錯的話細胞每分裂一次叫做一代。所以代數越高細胞總數理應會越多，還會以等比級數增加，這應該是邏輯上無懈可擊的推理吧，怎麼從推文感覺你很驚訝？我再幫你用我的assumption做一次總結，你取了不同數量顆細胞，收了protein，做了bradford, 拉了很漂亮的standard curve, 沒做quantitation/normalisation, 意思也就是你根本不知道你load到膠裡面的到底是相當於多少顆細胞的total protein，然後你期望你壓western blot的control會一樣粗?? 以上所有的東西都可以在google跟維基百科上面找到。大概都有中文版的了。學長姐沒教你至少要自己做點功課。 ※ 引述《palo1930 (隨欲而安)》之銘言： : 各位版友大家好，目前正在做NRK52E這株細胞做westen，在壓actin確定定量時發現，隨 : 著細胞代數越高，做出來的ben也越來越高...製作westen前有用elisa定量，定量結果皆 : 在0.995以上，想問有做這株細胞或是在做細胞westen的版友有沒有發生類似的情況？ : P.S實驗室4個人所製作的結果都一樣，actin皆是最大代數的sample ben標高。 : P.SS把actin改成GAPDH結果也是一樣。 -- 人好欠表 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 131.111.5.162 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493661338.A.D99.html

推

icheee

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