[求救] WB strip strip可信度

看板Biotech作者 (misakilin)時間7年前 (2017/04/27 21:50), 7年前編輯推噓2(2推 0噓 7→)
留言9則, 3人參與, 最新討論串1/2 (看更多)
想問一下版上的前輩們 我最近在跑WB 想看某個KINASE的磷酸化 依照別人的建議是先壓PHOSPHO 再壓TOTAL 但第一次結果出來磷酸化的確有改變趨勢 但是TOTAL的部分也有改變的現象 不確定是否是strip所造成的誤差還是什麼? （internal control沒問題，抗體是abcam，commercial stripping buffer） 想問phospho跟total在同一個位子 用strip壓是否有可信度的問題? （sample量有點多，如果都要跑二重覆會有加不完的班。。。） 另外想問，如果壓出來的band偏淡，而且背景較深，是應該調二抗還是一抗的比例?還是應該調整blocking的方式 （5%skim milk blocking ,santa cruz 的抗體（非磷酸化），一抗 1:500 二抗1:5000） 麻煩大家給我一點意見，謝謝 ----- Sent from JPTT on my Samsung SM-G930F. -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.230.78.34 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1493301013.A.52D.html
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04/27 22:55, , 1F
totel 也是有改變的可能，背景可以用 2~5% BSA 做blocking
04/27 22:55, 1F
好喔～下次換blocking方法看看，但是好怕被罵燒錢QQ
推
04/28 00:29, , 2F
有影響，有遇過磷酸化跟一般抗體會競爭的，所以後來直接
04/28 00:29, 2F
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04/28 00:30, , 3F
跑兩片以internal control做比較。（遇過reviewer要求
04/28 00:30, 3F
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04/28 00:31, , 4F
「所有」WB三重複的，實驗室總動員做到死.....）
04/28 00:31, 4F
希望我畢業前不用投稿or遇到兇猛的reviewer .... ※ 編輯: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:01:50 ※ 編輯: k60351p (114.42.70.234), 05/01/2017 23:02:42
推
05/11 14:44, , 5F
Phospho protein 建議用BSA blocking 所以total protein
05/11 14:44, 5F
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05/11 14:45, , 6F
也必須用BSA blocking 我覺得是blocking buf的問題
05/11 14:45, 6F
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05/11 14:46, , 7F
另外 total protein 本來就可能會變化 特別是隨著磷酸化
05/11 14:46, 7F
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05/11 14:47, , 8F
的比例變化 因為該treatment大概就是需要這蛋白活性 量
05/11 14:47, 8F
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05/11 14:47, , 9F
也通常跟活性成正比
05/11 14:47, 9F
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文章代碼(AID): #1P0VSLKj (Biotech)
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