Re: [求救] 如何找轉錄因子
※ 引述《QuteMango (芒果是藍波萬)》之銘言:
: 如果我找到一段基因
: 想要利用轉錄因子(TF)增強該基因的表現
如果你只是想增強該基因的表現,
千萬別用這種方法,
因為基本上沒有一個 TF 是只會針對單一基因作用的,
如果直接丟 TF 下去產生的副作用太多,
隨便一個教授都可以電你:
「你怎麼知道你看到的現象是從這個基因來的?
你怎麼知道這不是因為你放的 TF 去影響了其他基因?」
增強一個特定基因表現量的方法,
一般的做法是把那個基因的 ORF clone 到 expression vector 上,
用 vector 上的 promoter 去過量表現它。
: 請問該如何找到那些轉錄因子呢?
: 我目前想到的做法:
: 1.先找到該基因的promoter序列(如何找?)
: 2.找和該promoter相似序列的其他promoter的TF,看是否有可用的
要找到控制一個基因的所有調控單元是很困難的,
雖然部分基因大概 TSS ±5 kb 的序列就有大部分的調控單元,
或是直接找該基因的 CpG island,
可是例外太多了,
調控他的 TF 還有可能座落在數十甚至數百 kb 外的 locus 上,
就算你做 4C 也不一定能找到。
網路上有很多工具可以讓你找 TF,
像是
http://alggen.lsi.upc.es/
這個網站,
它可以幫你分析一段序列有可能會有哪些 TF binding,
可是首先他並沒有包含「所有」的 TF,
只有已知 binding motif 的 TF 能用這個方法,
並且這終究是 predition 而已,
此外一般來說多數 promoter 都會有很多共有的 TF,
像是 Sp1、Tbp 這些不太有 tissue specificity 的 TF ,
如果你背景知識不夠,
很難看出這個 TF 是否就是調控你基因的重要分子。
所以這個分析其實參考價值很低,
以我來說我覺得比較有用的用途是已經知道有某個 TF 會調控,
再用這個分析去找這個 TF 可能的 motif 在哪裡。
此外,
確定是哪些 TF 之後,
還要做 luciferase assay 去驗證,
這整個過程要做的事情非常非常多!
: 應該還有其他更好的方法
: 因為目前在這方面還很外行
: 所以不知道該如何搜索
: 第一次發文,如有錯誤請告知,謝謝。
總而言之,
如果你只是想增強這個基因的表現量,
一般我們都是把基因 clone 出來去過量表現,
而不會用 TF 去增強它的表現。
如果你真的很堅持,
就是要指定在 endogenous 的 gene locus 上下手,
的確是有一種方法可以達到你的需求,
就是 CRISPR/Cas9 的延伸應用:
http://igtrcn.org/over-expressing-insect-genes-using-cas9/
不過這個方法應該所費不貲,
而且也要檢查有沒有 off-target 的影響。
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 120.126.39.94
※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1476850249.A.FDA.html
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對耶!我完全是預設做真核多細胞去回答的...
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※ 編輯: xxtomnyxx (120.126.39.94), 10/19/2016 16:12:15
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正如我前面所說,
用這個分析來找未知的 TF 參考價值很低,
72 種可能還不包含實際上真的會去調控它的。
驗證的方法,
就是把這整段 clone 到 luciferase vector 上,
拿一個會表現 Snail 的 cell line,
把這個 vector 丟到細胞裡看 luciferase 的 activity,
確定這段 promoter 具有轉錄活性後,
在把上面可能的 motif 一個一個 delete 或 mutate 掉,
看看哪些 motif 去掉後 luciferase 的活性會顯著降低,
那麼這些 motif 可能就是調控 Snail 的重要 TF binding 的序列。
然而這是傳統的方法,
以現在研究的進展來看,
這個方法其實只有特定條件下是有用的,
現代的觀點認為基因的轉錄活性與 chromosome 3D 結構有關,
可是你 clone 到 luciferase vector 上的序列未必能完全模擬
endogenous gene locus 的 chromosome 3D 結構。
而且先決條件是你的這段序列真的就是 Snail 的 promoter,
就像我前面說的,
即使你在這 1.7 kb 上找到了重要的 TF site,
也不表示只有這個 TF 會調控 Snail,
可能在距離很遠的 locus 上也還有其他 TF 會調控 Snail。
※ 編輯: xxtomnyxx (120.126.39.94), 10/21/2016 19:41:25
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