Re: [求救] 請教製作stable clone cell line花的時間

看板Biotech作者silverberry (平行線上的交集....)時間8年前 (2016/06/08 14:34)推噓3(3推 0噓 18→)

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原文恕刪 m(_ _)m 第一次發長文，排版不良請見諒。剛好過去有建立 stable clone cell line 的經驗，在這裡跟大家分享。 ---------我是分隔線--------- 目前常用的病毒轉染系統有 retro, lenti, adeno, adeno-associated virus 各有優劣和適用範圍，可以搭配實驗室的需求挑選 (1)。廠商 Clontehc 有詳細的比較 (2) http://goo.gl/cVecku 簡單來說，可就三大部分考慮 host 雖然這些病毒系統的感染效率都不錯，但是總是會遇到一兩個難搞的 host cell line。另一個關鍵是 host cell 會不會分裂，這與病毒感染機制有關。 genome integration 載體/外源基因嵌入 host genome，雖然相對於以 episome 形式來說，更能確認不會在細胞複製過程中消失。但是嵌入 host genome 的位置可能會影響 host 本身的特性；或是受到 host genomic DNA epigenetic modification 的影響改變外源基因的表現。 transgene property 幾個？多大？表現量要多高？不同的病毒載體有不同的特性，載體設計也可以增加自由度。配合實驗室需求，挑選最適的系統可以減少額外的變因。在這裡 (因為個人偏見) 以 lentivirus system 為主 (3)。流程大概可以簡化為 virus packaging → infection host cells → selection virus packaging 合適的 HEK293T cell 作為 virus packaging 的 host。不加準備 packaging vector 的準備時間，被轉染的 HEK 293T cell 可以在 48-72 h 把 lentivirus 做出來。新鮮的 lentivirus 可以直接感染 host cell，或是分裝冷凍在 -80 備用 (4)。 infection host cells 把 lentivirus 病毒液加到 host cell 培養基中。理論上 24 h 就可以觀察到外源基因的表現。有時病毒對 host 太毒，host 會病懨懨的。感染條件稍微微調一下，host 在去除病毒液之後，都會慢慢好轉。 selection 常見的 drug selection 的 killing curve 漂亮的話，drug 篩選效果都不會太差。用 GFP/RFP 等等的 reporter，用 FACS 篩選也很方便。一切都是配合實驗室的設備和後續實驗的需求。時程和工作量上，stable pool 和 stable clone 會差很多。主要是 single cloning 的效率和工作量。參考廠商的網頁 http://goo.gl/ykbfzm 雖然這張圖是 CRISPR 的流程，感染兩次 lentivirus。不過一個 stable pool 和 clone 大概就是 2 週和 6 週的差別。 (當然是指一切就緒順利的情況下~) 到這裡為止，差不多就有想要的 cell line 可以繼續做研究了 (5)。備註 (1) 因為 iPS 很紅的 sendai virus 沒被列入討論。 (2) 有不少廠商都有賣這些系統。學校裡花小錢建立系統的方法也有很多~ (3) 未來 CAR-T 都可以打進人體了，lenti 系統 (對操作者) 的安全性應該 ok~ (4) 新鮮的病毒液配合需求盡快進行濃縮、純化、定量，4 度暫存的時間越短越好。 (5) 如果擔心細胞株穩定性，可能還要做一些穩定性測試等等，或是鑑定嵌入位點。 ---------我是分隔線--------- 感謝收看 m(_ _)m 當初進入這個領域時，受到版友大大們的照顧。以這篇 "心得文" 再次感謝領進門的版友師傅們。也希望可以大家可以一起分享心得~ -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 220.128.137.104 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1465367650.A.857.html

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