Re: [求救] qPCR做不出做不出預期結果?
※ 引述《hachibuya (黃金騎士 牙狼)》之銘言：
: 我實驗室在測某種藥物加到癌細胞後和放射線治療的關係
: 藥物的廠商有幫我們做DNA的microarray
看表現量的應該是mRNA microarray
: 跑出來後蛋白質fibronectin有很明顯如預期的差異
: (沒加藥global normalization為428, 加了藥的降到215)
: 因為只有microarry的data感覺很虛
: 所以老師說用realtime qPCR跑看看
: 我們的機器是Roche的LightCycler Nano
: 一開始是用SYBR GREEN染, 對照組是用18S
: 結果不同時間養的細胞做出來的結果很不一
: (對照組和加藥組間的結果很不穩定 有時算出來是對照組高 有時加藥組高
: 但相同sample做duplicate或triplicate是沒問題的)
: 甚至連相同的cDNA sample放了一周後也無法做出一樣的結果
: 後來另一個老師說這可能還是手的問題
: 建議我用hydrolysis probe 可以同一個sample裡染不同的cDNA
: 照了建議重新設計買了primer和probe
: 還有universal probelibrary GADPH的primer和probe
: 結果是可以在同smaple同時做出兩種基因的表現
: 但Cq值的relative 定量計算結果還是亂七八糟的
: 怎麼做都做不出microarry的結果
: 上網查了一下好像也沒有定論說microarry和qPCR的結果一定會一樣或不同
: 因為我不是生科本行出生的 不知道各為大大怎麼看?
1. mRNA microarray妳們做了幾重複?
如果只做一次的話，我只能說這個結果本身就不可信
任何實驗沒重複三次以上我都覺得可信度低
因為出來的結果可能會受到操作者手法的影響很大
超過三到五次都能重複才表示這個實驗有再現性
2. 如果你們array的實驗再現性很好得話
qPCR的驗證請不要用syb，這個靈敏度只適合做差異度極大的樣品
如果差異只是兩倍的話，請用taqman系統的驗證效力會比較好
3. 如果這樣還是結果不一樣表示??
(1) 養細胞有很多要注意的事項，是否有嚴格的遵守
尤其是這種放大表現得比較法，些微不同的培養
方式可能就會導致細胞本身表現出現異常。
(2) RNA轉cDNA的kit可能不好，請去買做microarray
或NGS的轉cDNA的kit來用。
4. Cq ratio 會亂跑表示實驗有操作問題或是probe靈敏度
有問題，實驗有問題通常都是出在sample preperation
的地方，我看過太多細胞實驗結果都是因為microplasma
影響，導致只要一換clone實驗就做不出來。
5. 我相信用以上的方法，妳們可以得到一個較精準的答案
可能結果不一定跟你們想的一樣，但是我相信至少結果
會很一致。
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