Re: [求救] TA cloning相關問題

看板Biotech作者 ( )時間8年前 (2015/08/02 02:23), 8年前編輯推噓5(5推 0噓 18→)
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既然提到colony PCR (cPCR)的需求 我也回應我的觀點 問題起源與關於cPCR的使用時機與功能 假使24,48甚至2x48都可以作為cPCR的組數 那不知道這個的limitation在哪裡？ 抑或熟手cPCR在3,4,或6組就足以挑到或幾乎都是candidate 那何不直接mini還多進行cPCR篩選？ 我對傳統RE-mediated cloning有以下兩種分類 必要步驟包括：準備insert,準備vector, ligation, transformation, mini-prep 協助步驟包括：insert/vector cleanup, ligation-check colony PCR, gel&sequence check cPCR非核心步驟,又有gel check與定序替代 所以我是這麼看cPCR的 當只有一開始完全沒人帶沒人問的時候，才有cPCR的妥協 但如果以xxtomnyxx板友熟悉操作,若cPCR能剔除的也才一兩顆，何不直上mini就好？ 因此我自認為cPCR可省略的理由至少有： 1.無法對mini-prep預先剔除做出貢獻 2.對太大的insert,不容易以兩端seq primer操作 3.台製每個mini-prep約8~20元，用cPCR看不出能省經費 4.我個人有同事協助,每少一個步驟就給對方少一個操作麻煩 以下是我以及我的助理同事的流程 template來源約7成自cDNA(<3kb), 2成購買clone(>3kb),約1成是gDNA Day 1, PCR amplify (25ul),全部拿去gel extraction pJET blunt-end ligation, transform Day 2, 早上pick up colony(3~4顆)，下午mimi-prep 五點前定序(其中2~3顆) Day 3, 下午比對定序, RE cut, insert extraction或cleanup Day 4, ligation, transform Day 5, pickup colony(3顆), mini-prep, gel check 若只是換vector Day 1, RE,gel extraction/cleanup, ligation, transform Day 2, pick up colony, mini-prep, RE cut, gel check, medi 放大 Day 3~5,可以從medi-prep,transfection做到收cell lysate 除了少數size太大,或序列本身不穩定 只要星期一從cDNA的25ul PCR有微弱band，基本上下週二都可以預期做transfection test (而且週末不用加班) 如果訊號夠強,也會跳過cloning vector直接送進expression vector， 這樣五天就有medi scale plasmid 通常有不順利都是是手上的cDNA無法在PCR放大 回到原po的問題，顯然是對自己使用產品的不熟悉 所以我才建議應該從protocol著手(以及其中的troubleshooting) 或者至少先向熟悉的前輩求救，而不是繼續用cPCR在白點中撈針 以下例子是我對我們lab用的產品的瞭解， 根據KOD或advantageII，可以決定要送2-6管去定序比較保險 從pJET效率，只要是colony不用跑膠就知道必有insert可以去定序 切Fastdigest，知道多久或要不要CIP可以挑不到self-ligate 用不同ECOS品系，可以知道長不出來跟transform無關 gel extraction/cleanup,elute體積不該是越少越好，TM會有說明 普通的I:V ligation，一般的10X ligase(NEB)就很方便，不必要2X 而且vector每次用10ng以足夠，一開始切0.5~1ug以內就好 如果該RE-cut vector沒self-ligation，冰-20可以放5年以上還可用 上述column kit除了gel extraction，其他也都用台廠 最後附帶一提，以下觀點也跟xxtomnyxx相反 對於暑期生或rotation 基於技術學習，我反而會介紹cPCR並且給予練習與嘗試機會 但如果是要常駐碩、博班學生 除非是自認為一定要挑一二十管而且用cPCR才是叫cloning這種自認很熟的新人外 我自己帶就一定跳過完全不考慮去提cPCR -- 以上提到的商品試劑皆由實驗室經費自行購買 文章內經驗分享無廠商以任何形式的贊助 -- 怎樣算是序列不穩定？ (複選) A) Donator提到該cDNA plasmid在37度長的100%都錯的， 要30度而且要48h才會有正確的 B) 有一顆,mini菌液在37度長到6～8h些微變濁(mini-prep, size不對)， 至16h完全澄清 C) 又有顆,mini菌液在37度8~10h有變濁(此時mini是對的)，放超過20h變更濁， 但plasmid會不見 D) 37度plate放16h，正常大的colony都是錯，要挑比satellite小的colony才是對的 E) RE-based insert，接進plasmid後挑去定序，每顆都有突變(indel, point m) 都在不同位置 ※ 編輯: blence (114.33.221.4), 08/02/2015 02:24:17
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因為我最近就有兩個 clone 直上 mini,結果是錯的，回頭
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做 cPCR發現沒有一顆菌落是對的......
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雖然我只挑了 7 顆但我知道其他的要挑到應該沒什麼機會
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然後其實你 day 2 時養 mini 也要等，如果沒其他實驗要
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做還是可以做個 2 in 1，這樣可以更確定可以拿到對的 p
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lasmid，就挑個3、4顆然後拿 cPCR 有訊號的抽 mini，可
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以避免失敗而花更多時間或浪費 mini column。
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因為成功率高,PCR就多餘了,除了用時間做其他事,也不想助理
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太麻煩,上面也說了,mini可能比PCR便宜喔;另外上面也有提
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我們常只抽mini不切RE甚至不跑膠直接送定序,就是對colony
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有信心,我們只怕cDNA沒band,只要有,很難mini會失敗
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pJET成功率真的很高，如果是用它的話我也是直接送定序
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在我們 Lab，colony PCR 並不是提高成功率的手段，是用來批
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量 construct 一堆東西時，省時間的方式。Colony PCR 在我們
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來看，真的對經費不友善；除非有些用到的方式比它還貴，例如
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稀有RE之類的。而且，在我們Lab，碩士生的方法訓練比出不出
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成果還重要。常規手段做不出來時，得找出問題和解決之道，當
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然能出成果是最好，畢竟這也影響畢業速度——當然，在文章
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revise 期間，一切都以 Publication 為重……Orz
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推
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cPCR主要是省時間但是耗費較昂貴的技術，看各人怎麼選擇
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推
08/03 14:44, , 22F
請教一下 大大們是用哪種酵素來做cPCR? 我P一個clone 1塊
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08/03 14:45, , 23F
我只是用普通的2X mix 產物2.5k內 band都很強阿...
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