[求救] RIPA buffer

看板Biotech作者 (TATA box)時間9年前 (2015/07/12 22:55), 9年前編輯推噓3(3推 0噓 17→)
留言20則, 6人參與, 最新討論串2/2 (看更多)
雖然這問題感覺笨笨的但還是問一下好了 在stable clone裡面 我的overexpress的 protein與lipid有interaction (有點像lipoprotein 最以前是用TX-100 bfr 但效果蠻差的 原本以為是stable clone沒建立好 後來用RIPA lysis後 western表現量有明顯的上升 但有個問題 我每次6 well 必須用500ul的lysis bfr表現量才會上升 (之前都用 100~150ul,lysis出來表現量只比TX100高一點) 而用500ul去lysis 每次loading都要下80ul左右 而且細胞還要長很滿 我在想是因為150ul太少了嗎? 還是因為我的RIPA detergent濃度太低? 目前有想到把SDS濃度提高至1% (看BCA kit說明書寫 如果是lipoprotein可用2%SDS之類的) 但怕會有意外 所以就上來問了 希望做過類似protein或有經驗的各位可以幫幫忙 謝謝~ ----------------------------------------------------------------- 目前RIPA 配方: 20mM TRIS pH7.5 150mM NaCl 1mM EDTA 1% NP40 0.5% DOC 0.1% SDS &protease inhibitor (Apr/Leu/PMSF) -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 118.168.116.143 ※ 文章網址: https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1436712941.A.A54.html
推
07/13 00:34, , 1F
可以參考abcam的ripa說明，非常詳細
07/13 00:34, 1F
我就是參考abcam的耶 看來還要念熟
推
07/13 01:59, , 2F
都用sigma RIPA R0278 抽protein都很多
07/13 01:59, 2F
我們家習慣全部bfr都自己泡 嗚
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07/13 07:50, , 3F
如果嫌protein loading 體積太大，可以將要跑的量另存一管後
07/13 07:50, 3F
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07/13 07:51, , 4F
在煮蛋白那一步，用不太高的溫度打開蓋子加熱一陣以減少體積
07/13 07:51, 4F
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07/13 07:56, , 5F
或是用vacuum dryer減少體積……不過，這樣蛋白不會太多嗎？
07/13 07:56, 5F
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07/13 07:57, , 6F
另外，可有考慮用digitonin取代Triton？
07/13 07:57, 6F
digi不是比tx100更弱的detergent嗎?(印象中) 雖然我看蠻多人做IF會用 家裡也還要找找
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07/13 09:17, , 7F
如果protein load需要用到80ul,應該換Ab或用IP比較好
07/13 09:17, 7F
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07/13 09:21, , 8F
6well用150ul應該會夠,還是你用on-dish lysis被稀釋掉了?
07/13 09:21, 8F
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07/13 09:24, , 9F
要是量的問題沒解決,別先BCA了,直接sample buffer lysis試
07/13 09:24, 9F
Ab應該不太能換 因為是自己lab打兔子來的 (很久以前就在用了 我的80ul大概是80ug (測濃度後加smp bfr的總體積) 主要是我們家不是跑小膠 是大膠 只load 50ug訊號不夠強 我是on-dish lysis 沒錯,但我加lysis bfr前會把plate斜放,把多的PBS吸掉 最後體積跟我加入的bfr是差不多的，稀釋應該不是主因 smp bfr直接lysis我是有聽過,但是不是DNA會全部跑出來 (?) 這樣還能另外加protease inhibtor嗎
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07/13 18:53, , 10F
我不認為on-dish lysis可以把PBS吸多乾淨,拿空盤試就知道
07/13 18:53, 10F
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07/13 18:56, , 11F
用150 lysis可以回收150,用tube都不見得這麼準,正暗示有多
07/13 18:56, 11F
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07/13 18:59, , 12F
的PBS在維持溼潤阿,這樣150小體積lyse效果不好是必然的
07/13 18:59, 12F
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07/13 19:03, , 13F
提到換Ab是你用oe蛋白訊號卻很差,或許有tag Ab可試
07/13 19:03, 13F
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07/13 19:09, , 14F
若非同細胞在一般transient下操作很正常,你遇到的是系統性
07/13 19:09, 14F
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07/13 19:12, , 15F
問題,純粹是偵測難度高於一般,跟stable clone無關
07/13 19:12, 15F
這樣應該先用PBS刮下來後 再用bfr lysis嗎 但刮的動作應該也會讓蠻多細胞破裂的(?) 還是就真的直接用sample buffer (這樣要怎麼定量阿~~ 其實也蠻好奇為什麼不用tag的 可能覺得加tag對protein function有影響吧 還要再測試 (我的15kda) 因為現在用的Ab是polyclonal 我的background永遠比訊號強= = 但老闆說沒差就是了 是說斜放的方法好像是b大發文中 下面推文的建議 ※ 編輯: tynse71864 (118.168.116.46), 07/14/2015 05:49:54
推
07/14 17:33, , 16F
on dish lysis 我覺得沒稀釋很多 不過我比較喜歡用urea/s
07/14 17:33, 16F
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07/14 17:33, , 17F
ds當lysis buffer
07/14 17:33, 17F
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07/14 18:25, , 18F
有沒有稀釋很多自行拿空的dish測試lysis buffer便知
07/14 18:25, 18F
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07/14 18:27, , 19F
原po遇到"150ul不行,500ul才能lyse",如果濃度沒變怎會如此
07/14 18:27, 19F
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07/20 15:30, , 20F
稀釋測試是+5～10ul左右
07/20 15:30, 20F
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