Re: [求救] 有關PCR的問題
※ 引述《polomi (polomi)》之銘言：
: ※ 引述《licat (licat)》之銘言：
: : 不好意思因為資訊太少，我想問一些問題便於判斷
: : 請問想去除的片段長度多大？
: 去除的片段長度約為450 bp，
: 而使用插入取代的抗性片段約為1.6 KB。
那你原本設計用來確認重組狀況的primer，離置換位置有段距離
會讓PCR困難度變高，可以考慮設計得近一點
(不過看你PCR的圖，這應該不是做不出來的主因)
: : 請問是甚麼抗生素基因？使用的互換機制是？
: 利用kanamycin 15ug/ml，
: 互換的機制是同源重組交換的方式。
: 有一個大陸的網站寫得滿淺顯易懂的，
: http://www.yrbio.com/service/red-et-recombination-technology
: 主要的參考是這篇paper
: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10829079
我用過這個系統，跟其他互換系統相比沒那麼順利
雖然看起來很簡單但不容易除錯，DNA電進去後都不知道出了啥事
如果你能找到用得很順的人，建議直接跟他請教
如果周圍沒有，而你又是作E. coli，我覺得你換用SacB系統做還比較好
: 各加上目標取代位置前後各50bp送入。
: 主要送入方式都是以電穿孔的方式。
:
: 因主要表現重組蛋白的質體為溫度敏感型，
: 過程中都有注意培養的溫度是否有低於30度。
: : 我覺得不像是PCR或抽DNA的問題，
: : 因為你的control反應很專一，這種PCR你沾一點菌落或菌液直接當模板都做得出來
: :
: : 所以你沒夾出來，我覺得比較可能是
: : 1. 那些長出來的菌落是污染的雜菌，沒有你primer可認得的序列
: : （如果你提供詳細實驗流程跟結果：
: 那個我有取只含有重組蛋白質體的菌來pcr過，
: 用原本的primer表現，
: 的確原本的片段長度約為1KB左右。
: 應該可以初步排除雜菌的可能性。
以上所述是無法排除的啦
但我猜那些菌落還是你的E. coli，而且有發生重組所以才有Km抗性，
然後你的PCR也才會變成作不出來
只是重組方式跟原本預期的不一樣...
: 恩我用附圖的方式可以嗎?
: http://ppt.cc/5iBm
: 請原諒我必須刪掉我的目標序列名稱。
:
: : 2. 那些菌落都是insertion mutants，然後你primer座落的位置被互換掉了
: : （這得看primer座落位置跟整個互換的設計）
: 阿~~~
: 希望不要阿。
: 我連發票都是一整年頂多中一張200的機會啊 QAQ
這跟機率無關，你應該找有經驗的人幫你看一下整個互換設計跟引子位置是否正確
:
: : 3. 那些菌落都是insertion mutants，primer也沒錯，
: : 但PCR反應沒有強到可以夾出2 KB大小，所以你可以：
: : (1) 將annealing降到50，沒出來再降到45，再沒出來就放棄
: : (2) 換別的廠牌的taq，直接測試50跟45度annealing
: : (3) 重新設計其他primer
: :
: 其實原先主要的annealing溫度為58度，
: 現在有嘗試過，
: 50 55 58 60 62 64，
: 主要都是30秒。
: 也有嘗試著加入DMSO，
: 其結果如下圖:
: http://ppt.cc/C99u
: : 我想你可以先測試上述的PCR條件，
: : 希望你annealing溫度一降就夾出來，問題解決~
: : 祝實驗順利
: 感謝您，
: 我會先嘗試著降低溫度試試看～
嗯...多了解後，我覺得改PCR條件的成功機率不高，但還是祝你好運
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推
02/13 10:35, , 1F
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