Re: [求救] microarray normalization原理

看板Biotech作者lelojack (莉羅夾克)時間9年前 (2014/11/06 03:33)推噓5(5推 0噓 10→)

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※ 引述《wouldfly (瑋瑋)》之銘言： : 是這樣的... 在看microarray data挑選一些顯著差異的candidates : 不免讓人想到是怎樣分析的，因為data分析前條件的設定，都會牽扯到可信度.. : 有一天有一位前輩跟我說 : http://ppt.cc/H9p9 這樣代表會有很多不可信的雜訊進去 : 但重點是我看不多懂這張圖~~~~~~ : 我有爬文或查過一些網路上的資料 : 像以下這些資料http://ppt.cc/H9p9 : http://www.slideshare.net/antiplastics/normalization-of-microarray : 或http://genpromarkers.com/Bioinformatics/Bioinformatics.html : 好像就是在解釋這個概念 : 但我還是看不懂那個盒鬚圖代表的概念是什麼，上下調整會影響什麼？ : 條件設高設低代表的意思？ : 不好意思~~~拜託懂得大大可以解釋，感激QQ "Normalization(正規化)是讓數據之間可以比較的前處理" 以qPCR來說，針對housekeeping gene數質的處理就是一種正規化之所以會有原始數質彼此不能比較的原因大部分在於operation variation(每次加樣的量都不同)跟platform background 過去Microarray 正規化也有人嘗試以qPCR的想法，把原始數值跟house keeping相除得到 delta CT，把這個數值當作正規化的數值。這種想法十分的生物，但是遇到兩個問題，第一個問題:housekeeping gene如何挑選? 高表現的housekeeping gene跟低表現的house keeping gene是不同的，而正規化的比較標準又要一致，第二個問題:真的有housekeeping gene嗎? 此外每間實驗室認為的housekeeping gene都有自己的一套know-how..... 由於housekeeping gene是人定義的，定義方式也不客觀我碩論也被正規化的問題問得很慘，也告訴念生資或念生物的千萬不要自己開發統計方法我們怎麼搞也無法說服統計學家........ 好的! 回來目前通行的正規化方式目前Micorarray正規化的基本假設是:"大部分的基因表現在所有樣品間的差異不大" 換句話說有差異的基因佔的比例很低這個假設捨棄了house keeping gene的概念，用population的概念去讓數值之間可以比較 http://genpromarkers.com/Systems_biology/img173.gif

上圖是原始數據，下圖是正規化的數值我們看到每筆"原始數值"的population都不同，違反上面提到的假設正規化後的數值就是調整每樣本的數值分佈是一樣的<-分佈!? 講到分佈~ 統計學家又高潮了~ 這就是我碩士論文又拖兩個月的原因每套正規化工具所定義的分佈，不同的假設下，數值分佈會不同回來看原始數值，我們可以了解Microaray的數值為何需要正規化 1. 我們可以看到有些樣品的原始數值普遍偏高，這就是我提到operation variation 我們無法肯定每次RNA下的量都一樣，因此整體數值就會不同 2. 我們可以看到有些樣品的variaion(iner-quataile range)小，而有些不是這可能也是hybridization技術的問題(platform background) 因為hybridazation的技術一直有over-saturation及none-specific noise的問題低表現的基因訊號會高估(因為有非專一的雜訊), 而高表現的基因訊號會低估(飽和問題) 也是有論文認為microarray是一個dynamic range相對不好的技術 (跟qPCR及RNA-seq相比, 我的工作跟NGS相關趁機酸一下Microarray) 不過microarray的相關資源也比較多，例如GSE, bioGPS 等等db 很多分析工具也很成熟，在一般分析工具上很少人會質疑而NGS的軟體還在蓬勃發展中........ 舉個例子來說GSEA的分析在官方網站方面說: The GSEA team has yet to determine whether any of these ranking statistics,......., are appropriate for use with expression data derived from RNA-seq experiments. (就說不要惹統計學家，統計學家沒時間處理的軟體就成敗自負拉) 所以.....正規化就是這樣有問題就再說吧 -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 122.146.55.199 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1415216000.A.596.html ※ 編輯: lelojack (122.146.55.199), 11/06/2014 03:40:21 ※ 編輯: lelojack (122.146.55.199), 11/06/2014 03:43:06

推

KittyGod

11/06 06:11, , 1^F

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推

liuse

11/06 07:00, , 2^F

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推

oplz

11/06 07:43, , 3^F

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oplz

11/06 07:44, , 4^F

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我修改文章在順便題一下NGS表達量的算法 RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads) 其實這個算法真的很單純，就是用基因的長度和定序的通量進行正規化由於NGS會讀到很多cDNA片段，最直觀的計算RNA表現的算法就是去計算cDNA片段的數量每條cDNA片段就是代表RNA表現的證據但是這有兩個bias: 1.基因越長，片段越多 2.定序總通量越大，所定序到的片段數量也越多因此計算上真的很單純 Mapped reads/(基因長度[kb]*定序通量[總條數]) 至於有沒有缺點，哥在碩士念完就沒認真念論文惹就等版上的強者來分享拉 ※ 編輯: lelojack (122.146.39.146), 11/06/2014 20:00:26

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blence

11/06 21:06, , 5^F

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blence

11/06 21:07, , 6^F

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推

oplz

11/07 14:50, , 7^F

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