[求救] 第二代 Lenti packing system 質體純化

看板Biotech作者silverberry (平行線上的交集....)時間10年前 (2014/06/04 05:07)推噓5(5推 0噓 23→)

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最近新手上路 lentivirus transfection 做 iPS 接到的第一個任務是準備 packing 用的載體 psPAX2 和 pMD2.G https://www.addgene.org/mammalianrnai/Packaging/ 2nd generation system deposited by the Trono lab 實驗室的學妹之前純化這兩個載體，是從 -80 glycerol cell stock (stbl3 strain) 養小量 0.5 mL 半天，然後傍晚放大到 200 mL overnight 到隔天，用 Qiagen 的 Hispeed midiprep 純化，最後分別得到 ~25 和 100 ug 的載體。遠遠不夠接下來的實驗需要。 (實驗室用的比例是 15 ug psPAX2 + 5 ug pMD2.G + 30 ug pLOVE-gene into 1 plate 至少要 8 個 plate) 我懷疑是 glycerol cell stock 不行了，所以新 transform 的 colony 養小量然後放大成 400 mL，隔天把 400 mL 的 culture 分成兩部分，其中的 5 mL 用 Qiagen 的 Miniprep 抽成 50 uL plasmid；剩下的用 Hispeed midiprep 純化成 1 mL。結果 5 mL 分別抽出 ~100 ug 和 ~37 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G 但是 midi 只抽出 ~23.5 ug和 ~95 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G (定量都是用 nanodrop) Miniprep 的 column 理論上是 20 ug 的 binding capacity，而 hispeed 是 200 ug。不管怎麼算都很覺得有點奇怪。三天後，我用新轉的 colony 重新養小量 30 mL，用 miniprep 重抽一次 (分成 6 管)，結果分別得到 ~20 ug 和 ~50 ug 的 psPAX2 和 pMD2.G 到這裡，實在卡關了， Addgene 上面說這個載體是 high copy，根據 QIAGEN 的說法，理論上會有 3-5 ug DNA/ml LB culture。看看自己這幾次的操作，只有新鮮 transform 的那天的 5 mL 抽出理想的量，其他都遠低於理論產量。請問版上的大家，我該怎麼改善我的步驟才能得到合理量的載體? 先謝過大家 m(_ _)m -- ※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 134.84.54.178 ※ 文章網址: http://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1401829665.A.04C.html

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grox

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roy047

06/04 08:07, , 2^F

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silverberry

06/04 09:26, , 3^F

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